1. Preparação experimental
- Prepare placas revestidas com matriz de membrana basal (BMM).
nota: O BMM solidifica mais rapidamente em temperaturas mais quentes. As placas devem ser preparadas rapidamente e imediatamente colocadas a 4 °C para armazenamento.
- Descongelar o BMM (ver Tabela de Materiais) no gelo, a 4 °C durante pelo menos 2 h, ou durante a noite.
- Misture o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) / F12 e BMM até uma concentração final de 80 μg / mL. Distribuir a solução de BMM em placas de cultura de tecidos (1 ml para placas de 35 mm e 2 ml para placas de 60 mm) e incubar a 37 °C durante pelo menos 1 h ou durante a noite antes de plaquear as células.
NOTA: Os pratos não utilizados podem ser armazenados a 4 °C por 2 semanas.
- Prepare placas revestidas com poli-L-ornitina/laminina (OLP/laminina).
- Prepare 20 μg / mL de PLO (consulte a Tabela de Materiais) em solução salina tamponada com fosfato estéril de Dulbecco (DPBS +/+) e adicione 1 mL a cada poço de uma placa de 6 poços. Incubar durante a noite a 37 °C na incubadora.
- No dia seguinte, aspirar o OLP com um aspirador a vácuo e lavar duas vezes com DPBS+/+. Secar ao ar no capô.
NOTA: As placas secas ao ar podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas, embrulhadas em papel alumínio, para uso futuro.
- Prepare 10 μg / mL de laminina (consulte a Tabela de Materiais) em DPBS +/+ e adicione 1 mL a cada poço de uma placa de 6 poços. Incubar pelo menos durante 3 h ou durante a noite a 37 °C na incubadora.
- Aspire a laminina com um aspirador a vácuo e adicione 1 mL de DPBS+/+.
médio ou estéril
NOTA: O revestimento da laminina não deve secar. PBS ou um meio de cultura apropriado deve ser adicionado imediatamente para evitar isso. As placas revestidas podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas.
- Prepare a solução de passagem PSC.
- Dissolva 11,49 g de cloreto de potássio (KCl) e 0,147 g de citrato de sódio di-hidratado (HOC(COONa) (CH2COONa)2*2H2O) em 400 mL de água estéril para cultura de células (ver Tabela de Materiais).
- Meça o volume da solução e registre-o como o volume inicial (Vi).
- Meça a osmolaridade e ajuste-a para 570 mOsm adicionando água estéril para cultura de células usando a fórmula Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
- Filtre a solução com um filtro de 0,20 μm e faça alíquotas de 10 mL. Armazene as alíquotas em temperatura ambiente (RT) por até 6 meses.
- Prepare meio de células-tronco pluripotentes (PSC).
NOTA: As iPSCs são mantidas em um meio contendo fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) estável ao calor (consulte a Tabela de Materiais), fornecendo um horário de alimentação sem fim de semana. Outros meios PSC disponíveis comercialmente não foram testados para este protocolo.
- Descongele o suplemento de meio PSC durante a noite a 4 °C.
- Adicione 10 mL de suplemento de meio PSC a 500 mL de meio PSC basal. Faça alíquotas de 25 mL e armazene a -20 °C.
NOTA: As alíquotas congeladas podem ser armazenadas a -20 °C por 6 meses. As alíquotas descongeladas devem ser armazenadas a 4 °C e utilizadas no prazo de 2 semanas. As células podem ser congeladas para armazenamento de longo prazo em meio PSC com 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO).
- Prepare o meio de descongelamento PSC.
- Suplemente o meio PSC com 50 nM de cromomano, 1,5 μM de emricasan, 1x suplemento de poliamina e 0,7 μM de trans-ISRIB (coquetel CEPT) (ver Tabela de Materiais).
- Filtre-esterilize com um filtro de 0,20 μm e armazene a 4 °C por até 4 semanas.
- Prepare pipetas de vidro puxado.
- Puxe as pipetas Pasteur de vidro de 22,9 cm (9 pol) em duas partes acima de um bico de Bunsen, ~ 2 cm abaixo do pescoço, criando duas pipetas, com o lado mais fino sendo ~ 4 cm mais curto que o outro.
- Com a ajuda da chama, dobre as pontas do lado puxado para criar um "r" suave.
- Coloque as pipetas puxadas em mangas de autoclave e autoclave para esterilização.
- Prepare o meio de diferenciação cerebelar (MDC).
- Misture o meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) e a mistura de nutrientes F12 de Ham na proporção de 1:1. Complemente a mistura com 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina, 1% (v/v) de concentrado lipídico quimicamente definido, 0,45 mM de 1-tioglicerol, 15 μL/mL de apo-transferrina, 5 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA) e 7 μg/mL de insulina (ver Tabela de Materiais).
- Esterilize por filtro com um filtro de 0,20 μm, armazene a 4 °C e use dentro de 1 mês.
- Prepare o meio de maturação cerebelar (CMM).
- Suplemente o meio neurobasal com 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina e 1x suplemento de N-2 (ver Tabela de Materiais).
- Filtre-esterilize com um filtro de 0,20 μm, armazene a 4 ° C e use dentro de 2 semanas.
2. Cultura iPSC sem alimentador
- Descongele as células seguindo as etapas abaixo.
- Colocar uma placa de BMM (passo 1.1) na incubadora a 37 °C para gelificar durante pelo menos 1 h ou durante a noite antes de descongelar as células.
- Pré-aqueça 10 mL de meio de descongelamento PSC (etapa 1.5) a 37 °C.
- Transferir o criovial com células do nitrogênio líquido para um banho-maria a 37 °C.
NOTA: Para evitar a geração de uma fonte de contaminação no espaço de cultura de células, não é recomendado o uso de um banho-maria padrão. Em vez disso, a água doce pode ser aquecida em um pequeno béquer a 37 °C para gerar um banho-maria de uso único.
- Quando sobrar um pequeno pedaço de gelo no tubo, retire-o do banho-maria, seque o tubo e borrife com etanol a 70%. Transfira o tubo para o exaustor e use uma pipeta sorológica de 2 mL ou 5 mL (consulte a Tabela de Materiais) para transferir suavemente as células para um tubo cônico de 15 mL.
- Adicione 8 mL de meio de descongelamento PSC às células gota a gota enquanto gira o tubo cônico. Centrifugue a 200 x g por 5 min em RT.
- Aspire cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo sem perturbar o grânulo celular. Ressuspenda as células em 2 mL de meio de descongelamento PSC.
- Aspire o BMM da placa e adicione as células ressuspensas gota a gota em toda a placa para uma distribuição uniforme.
- Coloque a placa na incubadora a 37 °C, 5% CO2. Atualize o meio no dia seguinte com o meio PSC. Depois disso, troque o meio diariamente.
- Mantenha as células seguindo as etapas abaixo.
- Pré-aqueça o volume necessário de meio PSC a 37 °C (por exemplo, 1 mL de meio por placa de 35 mm).
- Investigue as placas em busca de células ou colônias diferenciadas e remova as células diferenciadas com uma pipeta de vidro puxado (etapa 1.6).
NOTA: As colônias de iPSC têm bordas lisas com células morfologicamente idênticas.
- Troque o meio gasto diariamente e a passagem a cada 3-4 dias ou quando 70% de confluência for atingida.
- Passe as células.
- Coloque a quantidade necessária de placas BMM na incubadora por pelo menos 1 h ou durante a noite antes de passar. Pré-aqueça a quantidade necessária de meio PSC (passo 1.3) a 37 °C.
- Usando uma pipeta de vidro puxado, limpe todas as células ou colônias diferenciadas.
- Aspirar o meio gasto com um aspirador a vácuo e adicionar meio de dissociação PSC, 1 ml por cápsula de 35 mm. Incubar a 37 °C por 1-3 min.
NOTA: Se as colônias estiverem decolando na solução de passagem de PSC antes de adicionar o meio PSC, o tempo de incubação pode ser reduzido.
- Aspirar a solução de passagem PSC e adicionar meio PSC pré-aquecido.
- Usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μL, risque as linhas paralelas umas às outras em uma direção, gire a placa 90° e faça um segundo conjunto de linhas de arranhões perpendiculares às anteriores (fazendo um padrão hachurado na placa).
- Aspire a solução BMM das placas de fixação. Coletar as colônias usando uma pipeta sorológica e distribuí-las em novas placas de BMM.
- Incubar a 37 °C, 5% CO2. Mude o meio diariamente.
- Congele as células.
- Prepare criogenias rotulando o conteúdo e esterilize sob luz ultravioleta (UV) no exaustor (consulte a Tabela de Materiais) por 30 min.
- Prepare o meio de congelamento PSC suplementando o meio PSC com 10% (v / v) de DMSO. Siga as etapas 2.3.2-2.3.5.
- Transferir as células para um tubo cónico de 15 ml com uma pipeta serológica de 5 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min em RT.
- Aspire cuidadosamente o meio e ressuspenda o pellet celular em meio de congelamento PSC.
- Distribua em criogeniais. Coloque os frascos para injetáveis em um recipiente de congelamento e coloque o recipiente em um freezer de -80 ° C.
- No dia seguinte, transfira os criogenianos para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.
3. Diferenciação cerebelar
NOTA: Antes de iniciar a diferenciação, as iPSCs são passadas para seis pratos de 35 mm e estão prontas para a diferenciação quando estão a 70% de confluência. Cada placa de 35 mm será transferida para um poço da placa de 6 poços.
- No dia 0, levante as colônias de iPSC saudáveis para a formação de EB.
- Adicione 1 mL de MDL (etapa 1.7) suplementado com 10 μM de Y-27632 e 10 μM de SB431542 (consulte a Tabela de Materiais) a cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa (ULA) de 6 poços e coloque na incubadora até que as colônias levantadas estejam prontas para serem adicionadas aos poços.
- Limpe as células diferenciadas usando uma pipeta de vidro puxado. Aspirar o meio e adicionar 1 ml de solução de passagem de PSC por cada cápsula de 35 mm. Incubar por 3 min a 37 °C, aspirar e adicionar 2 mL de MDL suplementado com 10 μM de Y-27632 e 10 μM SB431542.
nota: Se as colônias estiverem decolando na solução de passagem PSC antes de adicionar o MDL, o tempo de incubação pode ser reduzido.
- Sob um microscópio invertido de luz transmitida, levante suavemente as colônias usando a borda dobrada da pipeta de vidro puxada usando ampliação de 4x. Assim que cada colônia for levantada, transfira suavemente tudo para um poço da placa ULA de 6 poços usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Repita esse processo para cada placa iPSC. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2.
nota: Se as colônias forem muito grandes ou estiverem fundidas, elas podem ser cortadas com a ponta da pipeta de vidro puxado para criar EBs menores.
- No dia 2, adicione FGF2 a cada poço até uma concentração final de 50 ng/mL.
nota: O FGF2 usado para diferenciação cerebelar não é estável ao calor. Este protocolo não foi testado com FGF2 estável ao calor.
- No dia 7, faça uma mudança média de 1/3. Para 3 mL de meio total em um poço, com um pipetador de 1.000 μL, aspire suavemente 1 mL de meio gasto e substitua-o por 1 mL de MDL fresco. Incube os EBs por 7 dias.
- No dia 14, aspire suavemente quase todo o meio gasto usando um pipetador de 1.000 μL. Para garantir danos mínimos aos EBs, gire a placa para reunir todos os EBs no centro da placa e, em seguida, incline a placa e aspire lentamente a partir da borda.
- À medida que a quantidade média diminui, coloque lentamente o prato na horizontal e continue a aspirar. Deixe meio suficiente para evitar o ressecamento dos EBs. Em seguida, adicione 3 mL de MDL fresco suplementado com 10 μM de Y-27632. Transferir os EBs usando uma pipeta sorológica de 10 mL para um prato revestido com PLO/laminina (etapa 1.2).
nota: Dependendo da aplicação a jusante, os EBs podem ser transferidos para uma placa PLO/laminina de 6 poços ou EBs individuais podem ser transferidos para um único poço de uma placa ou lamínula de 24 poços revestida com PLO/laminina.
- No dia 15, aspire o meio e substitua-o por um novo CDM.
nota: É importante adicionar meio suficiente aos poços para garantir meio suficiente entre as alimentações, pois, com o tempo, haverá evaporação (por exemplo, para um poço em uma placa de 6 poços, adicione 3 mL de meio). Se o meio começou a acidificar (ficar claro e amarelo), atualize o meio mesmo que não esteja no horário de alimentação até o final do protocolo.
- No dia 21, aspire o meio gasto e substitua-o por CMM. No dia 28, troque o meio por uma CMM nova. No dia 35, colha as células para outras aplicações.
