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1. Diferenciação HiPSC em neurônios mistos e glia
NOTA: O procedimento leva aproximadamente 28 dias para ser concluído, com as principais etapas descritas na Figura 1.
- Geração de corpos embrióides (EBs) (Dias 0 → 1)
NOTA: Este procedimento requer boas habilidades manuais e precisão. Os fragmentos de colônias de HiPSC (células-tronco pluripotentes induzidas por humanos) devem ser de tamanho igual para obter corpos embrióides homogêneos (EBs) nas próximas etapas. Colônias morfologicamente diferenciadas (com grandes frações citoplasmáticas e pequenos nucléolos) devem ser descartadas.
- Atualize o meio hiPSC (placa de Petri de 3 mL / 60 mm) antes de cortar as colônias hiPSC indiferenciadas (cerca de 1 mm de diâmetro, consulte a Figura 2A) em condições estéreis.
- Corte as colônias indiferenciadas (como mostrado na Figura 2A e Figura 2B) em fragmentos de aproximadamente 200 μm x 200 μm usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 30G. Use um microscópio estereoscópico com ampliação de 4X em um gabinete de fluxo laminar à temperatura ambiente.
- Separe os fragmentos de colônia da superfície do prato usando uma pipeta de 200 μL pipetando suavemente o meio por baixo para levantar os pedaços.
- Transfira todos os fragmentos destacados e o meio para um tubo de 15 mL usando uma pipeta de 1, 2 ou 5 mL.
- Lave o prato com 2 mL de meio hiPSC completo para recuperar todos os fragmentos.
- Centrifugue a 112 x g por 1 min.
- Aspire o sobrenadante e ressuspenda suavemente os fragmentos em 5 mL de meio hiPSC EB completo (consulte a Tabela de Materiais).
- Coloque os fragmentos de colônia em uma placa de Petri de fixação ultrabaixa de 60 mm (placa de Petri de 5 mL / 60 mm).
- Incubar a placa de Petri durante a noite a 37 °C e 5% de CO2.
- No dia seguinte (Dia 1), colete os EBs e seu meio em um tubo de 15 mL usando uma pipeta de 1, 2 ou 5 mL.
- Centrifugue os EBs a 112 x g por 1 min.
- Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda suavemente os EBs em 5 mL de meio EB hiPSC completo usando uma pipeta de 1, 2 ou 5 mL.
- Recoloque os EBs em uma nova placa de Petri de fixação ultrabaixa de 60 mm (placa de Petri de 5 mL/60 mm).
- Incubar a placa de Petri durante a noite a 37 °C e 5% de CO2.
- No Dia 1, cubra os pratos com matriz de membrana basal (por exemplo, matrigel, doravante denominada "matriz padrão") ou qualquer outro substrato proteico adequado (por exemplo, laminina).
- Armazene a matriz padrão (consulte a Tabela de Materiais) a -80 ° C em alíquotas de 200 μL usando tubos frios de 1,5 mL e pipetas frias de 5 ou 10 mL.
- Descongele 200 μL de matriz padrão no gelo.
- Diluir 200 μL de matriz padrão em 20 mL de meio basal (DMEM/F12) (diluição 1:100).
- Cubra as placas de Petri de 60 mm com esta solução (5 mL / prato).
- Incubar os pratos revestidos a 37 °C durante a noite.
nota: Essas placas serão usadas para plaquear os EBs (cerca de 50 EBs/prato) e gerar agregados neuroepiteliais (rosetas); Consulte a etapa 1.3.
- Geração de agregados neuroepiteliais (rosetas) (Dias 2 → 7)
- No Dia 2, remova a solução de revestimento de matriz padrão das placas de Petri de 60 mm (sem necessidade de enxaguar as placas) e encha-as com 5 mL / prato de meio de indução neuroepitelial completo (NRI); consulte a Tabela de Materiais.
- Transfira os EBs flutuantes (da etapa 1.1.14) para pratos revestidos (~ 50 EBs/prato) usando uma pipeta de 200 μL sob um microscópio estereoscópico com ampliação de 4x e colocado em um gabinete de fluxo laminar.
nota: É fundamental selecionar EBs homogêneas e de tamanho médio (~ 200-300 μm de diâmetro). EBs muito pequenos podem não sobreviver bem durante a diferenciação neuroectodérmica, enquanto EBs muito grandes tendem a sofrer necrose central.
- Incubar os pratos a 37 °C e 5% de CO2.
- No dia seguinte (Dia 3), verifique os pratos ao microscópio com ampliação de 10x para garantir que os EBs estejam todos conectados.
- Execute suavemente uma troca total de meio com um meio NRI completo.
- Troque o meio NRI a cada dois dias até o dia 7, quando os agregados neuroepiteliais (rosetas) devem estar visíveis.
- No dia 7, cubra a matriz padrão (ou laminina), conforme descrito na etapa 1.2, em qualquer formato de placa ou prato necessário: placas de 96 poços (100 μL/poço), placas de 24 poços (250 μL/poço), placas de 12 poços (500 μL/poço), chips MEA (para atividade elétrica, 1 mL/chip de poço único) ou placas de Petri de 60 mm (4 mL/prato).
- Incubar as placas/placas revestidas durante, pelo menos, 2 h a 37 °C e 5% de CO2.
- Dissociação de roseta e diferenciação neuronal (Dias 8 → 28)
NOTA: Este procedimento requer boas habilidades manuais e precisão. Para evitar a coleta de células mesodérmicas e endodérmicas, apenas estruturas semelhantes a rosetas ectodermas devem ser dissociadas e coletadas.
- No dia 8, corte as estruturas semelhantes a rosetas em fragmentos sob um microscópio estereoscópico com ampliação de 10X em condições estéreis. Use uma seringa de 1 mL com uma agulha de 30G. Observe que as rosetas tendem a se desprender do prato quando tocadas facilmente com a agulha.
- Complete o descolamento dos fragmentos de roseta usando uma pipeta de 200 μL.
- Transfira o prato sob a capela de fluxo laminar e colete os fragmentos de roseta e seu meio em um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta de 1, 2 ou 5 mL. Lave o prato com 2 mL de meio NRI para recuperar todos os fragmentos.
- Gire os fragmentos de roseta a 112 x g por 2 min.
- Aspire o sobrenadante.
- Ressuspenda suavemente o pellet em 1 mL de 1x DPBS (sem cálcio e magnésio) e pipete suavemente os fragmentos de roseta para cima e para baixo usando uma pipeta de 1.000 μL para dissociá-los parcialmente.
- Adicione 4 mL de meio NRI completo e conte as células usando azul de tripano e um contador de células automatizado (consulte a Tabela de Materiais)
nota: Diluir 20 μL de suspensão celular em 20 μL de azul de tripano. Esta etapa pode ser omitida se as células não puderem ser colocadas em uma suspensão de célula única. Se os fragmentos de roseta não parecerem completamente dissociados, os fragmentos de roseta derivados de cerca de 50 EBs/prato de 60 mm podem ser ressuspensos em 50 mL de meio NRI completo e plaqueados, conforme indicado na Tabela 1.
- Aspire a solução de revestimento de matriz padrão (ou laminina) das placas de Petri, placas e/ou chips MEA (da etapa 1.3.7). Não os deixe secar.
- Coloque as células em um meio NRI completo de acordo com o plano de estudo (cerca de 15.000 células/cm2; consulte a Tabela 1 para indicações de volume de plaqueamento).
- Incubar as placas durante a noite a 37 °C e 5% de CO2.
- No dia 10, execute uma mudança total do meio usando um meio de diferenciação neuronal completo (ND); consulte a Tabela de Materiais.
- Atualize o meio ND completo duas vezes por semana até o dia 28.
Tabela 1.
Nota sobre a densidade de roseta dissociada: se os fragmentos de roseta não parecerem completamente dissociados, a fim de atingir uma densidade de plaqueamento celular de cerca de 15.000 células/cm2, os fragmentos de roseta dissociados derivados de cerca de 50 EBs/1 x 60mm-dish podem ser ressuspensos em 50 mL de meio NRI completo e plaqueados da seguinte forma (dependendo do formato da placa):
| Placas multipoços / MEA | Área de crescimento (cm2/poço) | Volume da suspensão da célula para a placa por poço (ou chip MEA) | Número máximo de placas que podem ser plaqueadas (com 50 ml de suspensão celular) |
| 96 poços | 0,3 | 100 ul | 5 |
| 48 poços | 0,7 | 220 ul | 4 |
| 24 poços | algarismo | 625 ul | 3 |
| 12 poços | 4 | 1,25 ml | 3 |
| 6 poços | 10 | 3.125 ml | algarismo |
| Chip MEA de poço único | 3.5 | 1,1 ml | 45 |
