Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Dissociação de células do mesencéfalo ventral
- Transfira os pedaços do mesencéfalo ventral sob uma capa de fluxo laminar. Remova a solução salina balanceada de Hanks (HBSS) e adicione 1 ml de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético a 0,05% pré-aquecido (37 ºC) no tubo cônico (volumes suficientes para até 12 pedaços de mesencéfalo ventral). Incubar o tecido a 37 ºC durante 5-10 min.
- Remova a tripsina-EDTA sob o capô e adicione 1 ml de meio de desativação (o soro desativará a tripsina) ao tecido.
- Retirar o meio de desativação e lavar o tecido em 1 ml do meio completo duas vezes.
nota: Para evitar o descarte das células dissociadas, evite remover todo o meio do tubo e pipetar o tecido.
- Adicionar 1 ml de meio completo e triturar o tecido com uma pipeta de vidro polido a fogo. Evite a formação de bolhas e continue triturando até que uma suspensão unicelular seja alcançada.
NOTA: Normalmente, são necessárias 8 a 10 passagens pela ponta restrita para a dissociação completa.
- Centrifugue as células a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT) e retire o meio.
- Ressuspenda o pellet em 1 ml de meio completo, pipetando lentamente para cima e para baixo até quatro vezes.
2. Revestimento de células do mesencéfalo ventral
- Misture 10 μl da suspensão celular com 90 μl de solução de azul de tripano e conte o número de células com um hemocitômetro.
nota: A viabilidade das células também pode ser verificada nesta fase.
- Coloque as tampas dos tubos de microcentrífuga esterilizados em placas de Petri de 100 mm e transfira as lamínulas revestidas com poli-L-ornitina/laminina, usando uma pinça, uma de cada vez em cima das tampas.
nota: Não lave as lamínulas e evite secar a laminina, pois isso pode causar culturas irregulares e diminuir a capacidade de sobrevivência das células.
- Ajuste o volume para 1.500 células por 1 μl adicionando um meio completo e 100 μl (total de 150.000 células) da suspensão celular em cima de cada lamínula (o volume é ideal para cobrir a superfície da lamínula sem derramamento). Feche as placas de Petri e incube-as por 1 hora em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada (37 °C, 5% CO2).
nota: ETAPA CRÍTICA: Esta etapa é necessária para aumentar a fixação e a viabilidade das células e aumentar o número de lamínulas por embrião. Alternativamente, as células podem ser transferidas diretamente para os poços (contendo lamínulas), mas o número de células deve ser aumentado para 350.000 por poço (em vez de 150.000). Em outras palavras, usando esse método, 8 a 10 lamínulas podem ser adquiridas, enquanto a transferência direta rende cerca de 3 a 4 lamínulas por causa das células que se prendem às placas (ao lado ou embaixo das lamínulas). A viabilidade média das culturas que utilizaram esse método foi de cerca de 90%.
3. Crescimento e Manutenção da Cultura
- Após 1 hora de incubação, transfira cuidadosamente as lamínulas, incluindo o meio, para placas de 24 poços contendo 400 μl de meio completo pré-aquecido (a 37 ºC) (volume total: 500 μl). Incubar as células durante a noite (O/N) a 37 ºC.
- Dentro de 24 horas após a incubação dos poços, adicione suavemente 500 μl de meio completo em cada poço.
NOTA: As primeiras horas são o estágio mais crítico para a sobrevivência dos neurônios dopaminérgicos, e o número de células sobreviventes não muda significativamente além desse ponto.
- Não adicione meios adicionais às culturas nas primeiras duas semanas ou até que o meio fique amarelo. Se a cultura for cultivada por mais de duas semanas ou se a cor do meio mudar para amarelo, troque metade do meio (500 μl) por meio pré-aquecido fresco e completo (normalmente a cada duas semanas).
nota: Os neurônios dopaminérgicos dentro das culturas sobreviveriam por mais de seis semanas nessas condições.
