Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Obtenção de amostras de tecido
NOTA: Um componente crítico deste protocolo requer o manuseio adequado da doação de tecido começando imediatamente no momento da autópsia. A viabilidade geral da amostra depende significativamente da minimização do Intervalo Post-Mortem (PMI), transferindo imediatamente o tecido para o meio frio apropriado suplementado com antibióticos/antimicóticos, mantendo a amostra em gelo úmido durante todo o transporte e mantendo a técnica estéril durante todo o protocolo.
- Após a notificação de uma doação iminente, prepare um kit de coleta de amostras. Usando uma caixa de remessa com um recipiente isolado que pode ser usado diretamente para o transporte de retorno da amostra de tecido, inclua os seguintes materiais:
- Inclua materiais para preparação estéril, incluindo luvas estéreis, cortinas e bisturis.
- Inclua 8 a 10 tubos cônicos estéreis de 50 mL contendo 30 mL de mídia de transporte no recipiente isolado com gelo ou compressas frias.
nota: Embora qualquer meio de cultura celular padrão possa funcionar, a melhor viabilidade da amostra é obtida com o Hibernate-A suplementado com antibiótico/antimicótico.
- Inclua quaisquer outros tubos de amostra para outras análises (por exemplo, fixadores).
- Se a autópsia não for realizada no local do investigador, inclua um documento que indique claramente como coletar a amostra do tumor. Isso inclui detalhes como manter a esterilidade, manter tubos de amostra em gelo úmido e incluir amostras do mesencéfalo e da medula, pois as células tumorais geralmente invadem essas regiões.
- Manter a esterilidade durante a autópsia. Considere o cérebro estéril dentro do crânio, portanto, observe a técnica estéril (incluindo a troca de luvas) quando o crânio estiver aberto. Evitar a contaminação com pele e cabelo é fundamental.
- Disseque o tumor do lado ventral (a "barriga" da ponte, veja a Figura 1). Com um bisturi estéril, corte pequenos pedaços de 1 cm do tumor e transfira imediatamente para um meio de transporte frio (consulte a NOTA na etapa 1.1.2) e coloque em gelo úmido. Colocar 10 mL de tecido em cada tubo, resultando em um volume final de tecido e meio em cada tubo de 40 mL.
nota: No caso do glioma pontino intrínseco difuso (DIPG), o tumor se infiltra difusamente na ponte e, freqüentemente, no resto do tronco encefálico. Como tal, colete o máximo possível da amostra, normalmente incluindo 3 a 4 tubos (30 a 40 mL de tecido) da ponte e 1 a 2 tubos (10 a 20 mL de tecido) cada um do mesencéfalo e da medula.
- Colete amostras do mesencéfalo e da medula justapostas à ponte, que geralmente contêm muitas células tumorais.
- Após a coleta da amostra, envie as amostras durante a noite (O/N) em gelo úmido no recipiente isolado. Não envie a amostra em gelo seco, pois o congelamento matará as células.
2. Preparação para processamento de amostras
- Antes de iniciar a preparação da amostra, esterilize as capuzes de cultura de tecidos junto com lâminas de barbear, hemostáticos curvos e quaisquer outras ferramentas não estéreis sob luz ultravioleta (UV) por 1 h. Execute todas as etapas a seguir em condições estéreis para evitar a contaminação das culturas.
- Prepare e esterilize soluções de filtro.
- Para preparar a solução de sacarose 1,8 M, dissolva 308,07 g de sacarose em 300 mL de água destilada. Adicione 50 mL de solução salina tamponada com Hank 10x (HBSS) sem cálcio ou magnésio e traga o volume total para 500 mL usando água destilada. Conservar a 4 °C.
- Para preparar a solução de digestão enzimática, tomar 50 mL de HBSS com cálcio e magnésio para cada 10 mL de tecido picado e adicionar 500 μL 5 mg/mL de desoxirribonuclease I (concentração final de 50 μg/mL), 500 μL de 2,5 mg/mL de colagenase I/II e dispase e tampão de 500 μL de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) 1 M. Solução de digestão pré-quente em banho-maria a 37 °C.
- Para preparar a base do meio do tronco tumoral (TSM), misture 250 mL de Neurobasal-A, 250 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mistura de nutrientes F12 (DMEM/F12), 5 mL 100x antibiótico-antimicótico, 5 mL 200 mM de dipeptídeo L-alanil-L-glutamina (GlutaMAX-A), 5 mL de tampão HEPES, 5 mL de piruvato de sódio 100 mM e 5 mL de aminoácidos não essenciais 100x MEM.
- Para preparar TSM completo com fatores de crescimento, adicione os seguintes suplementos à base de TSM: 50x Suplemento B27 Menos Vitamina A (1:50), Fator de Crescimento Epidérmico humano (H-EGF, 20 ng/mL), Fator de Crescimento de Fibroblastos humanos (H-FGF, 20 ng/mL), Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas Humanas AA (H-PDGF-AA, 10 ng/mL), Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas Humanas BB (H-PDGF-BB, 10 ng/mL) e solução de heparina (2 μg/mL).
- Pré-arrefecer uma centrífuga de laboratório equipada com um rotor de balde oscilante a 4 °C.
3. Dissociação Mecânica
- Transferir o tecido para uma placa de cultura de células de parede alta de 100 mm x 20 mm. Remova o meio restante do transporte e substitua por 10 a 15 mL de meio de cultura a frio.
- Usando os hemostáticos curvos para segurar uma lâmina de barbear, pique o tecido finamente enquanto remove vasos sanguíneos ou meninges óbvios.
nota: Os fragmentos finais de tecido devem ser menores que 1 mm (ver Figura 2B).
- Transfira o tecido para um tubo cônico limpo de 50 mL. Lave a placa de cultura de células com mais 5 ml de meio de cultura a frio e transfira para o tubo cónico. Repita esta etapa de lavagem conforme necessário para transferir o tecido restante.
- Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, triture suavemente (4 a 5 vezes). Permita que fragmentos de tecido maiores se depositem no fundo do tubo. Se necessário, centrifugue brevemente a amostra durante 1 min (350 x g, 4 °C).
- Recolher a fração dissociada mecanicamente.
- Remova o sobrenadante e filtre-o através de um filtro de 100 μm em um novo tubo cônico de 50 mL rotulado como "Dissociação Mecânica". Inverta o filtro sobre o tubo cônico original e lave com meios de cultura para recuperar fragmentos de tecido.
- Centrifugue a fração de "dissociação mecânica" por 5 min (350 x g, 4 °C).
- Remova o sobrenadante da fração "Dissociação Mecânica" peletizada e ressuspenda o tecido em meio de cultura a frio. Se houver mais de 5 mL de tecido no tubo cônico de "Dissociação Mecânica", divida o tecido em outros tubos cônicos de 50 mL, de modo que nenhum tubo tenha mais de 5 mL de tecido.
- Conservar a fracção dissociada mecanicamente no gelo até à fase de centrifugação do gradiente de sacarose (passo 5). Alternativamente, a fração dissociada mecanicamente pode prosseguir para a Etapa 5 durante o período de incubação da dissociação enzimática (Etapa 4.4).
4. Dissociação enzimática
- Se houver mais de 5 mL de tecido no tubo contendo os fragmentos de tecido maiores restantes, divida o tecido em outros novos tubos cônicos de 50 mL, de modo que nenhum tubo tenha mais de 5 mL de tecido.
- Centrifugar o(s) tubo(s) cónico(s) que contém os restantes fragmentos de tecido durante 5 min (350 x g, 4 °C).
- Remova o sobrenadante e adicione a solução de digestão enzimática pré-aquecida, de modo que haja 5 mL de solução de digestão para cada 1 mL de tecido (por exemplo, 25 mL de solução de digestão para 5 mL de tecido).
- Selar as tampas dos tubos cónicos com película de laboratório e incubar a reacção num rotador a 37 °C durante 30 min.
- Após a incubação, triturar as amostras suavemente (ver figura 2C).
- Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, pipete a amostra para cima e para baixo 6 a 8 vezes. Evite gerar bolhas de ar excessivas.
- Adicione uma ponta de pipeta de 1.000 μL à extremidade da pipeta e triture mais 6 a 8 vezes.
- Deixe que os pedaços restantes se depositem no fundo do tubo. Remova e filtre o sobrenadante com as células ainda suspensas através de um filtro de 100 μm em um novo tubo cônico de 50 mL rotulado como "Dissociação Enzimática" e armazene em gelo.
- Se permanecerem fragmentos de tecido significativos, adicione mais 10 mL de HBSS com cálcio e magnésio aos fragmentos e repita as etapas 3.5.1 e 3.5.2. Filtrar esta solução final através de um filtro de 100 μm para o tubo de "Dissociação enzimática".
- Centrifugue o tubo de "Dissociação Enzimática" por 5 min (350 x g, 4 °C) e continue a centrifugação com gradiente de sacarose.
5. Centrifugação de gradiente de sacarose
- Se as amostras ainda estiverem suspensas na solução, centrifugue durante 5 min (350 x g, 4 °C).
- Remover o sobrenadante e ressuspender o tecido em 20 mL de HBSS frio sem cálcio e magnésio. Aumente o volume para 25 mL no total com HBSS frio.
- Adicione lentamente 25 mL de solução de sacarose 1,8 M e inverta o tubo para misturar. Isso resulta em um gradiente de sacarose de 0,9 M.
- Centrifugue sem freio por 10 min (800 x g, 4 °C). O uso de um freio de centrifugação interromperá o gradiente e reduzirá o rendimento (consulte a Figura 2D para obter um exemplo de uma amostra antes e depois da centrifugação).
- Aspire cuidadosamente os detritos de mielina e o máximo de solução de sacarose possível. Lave a amostra adicionando 30 mL de HBSS frio sem cálcio e magnésio e misturando suavemente. Centrifugue durante 5 min (350 x g, 4 °C).
6. Lise de glóbulos vermelhos ACK
- Remova o sobrenadante de lavagem. Adicione 5 mL de tampão de lise ACK e ressuspenda suavemente o pellet celular, girando o tubo por 1 min em RT.
- Extinguir a lise adicionando 30 mL de HBSS frio sem cálcio e magnésio.
- Centrifugue durante 5 min (350 x g, 4 °C).
7. Manutenção inicial da cultura
- Ressuspenda os grânulos celulares finais em 10 a 15 mL de TSM completo quente com fatores de crescimento e quantifique a densidade celular viável em um hemocitômetro usando a exclusão de azul de tripano.
nota: A gama de células viáveis varia muito, dependendo das circunstâncias da doação de tecido, e a quantificação pode ser difícil neste estágio inicial devido aos restos de detritos celulares. Em um caso ideal, procure ter um milhão de células vivas por amostra. Nos casos em que permaneçam detritos excessivos, colocar uma placa em uma densidade mais baixa em um balão T175.
- Transferir as suspensões celulares finais para um novo balão de cultura T75. Aumente os fatores de crescimento adicionais a cada dois dias para manter os níveis gerais de fator de crescimento e monitorar o desenvolvimento de neuroesferas de células tumorais (ver Figura 2E e Figura 3).
