Diferenciação de células progenitoras neurais da medula espinhal em neurônios motores

Resumo

Fonte: Taga, A. et al., Estabelecimento de uma Plataforma Eletrofisiológica para Modelagem de ELA com Astrócitos e Neurônios Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Humanas Regionalmente Específicas. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo mostra um método para diferenciar células progenitoras neurais da medula espinhal (NPCs) em neurônios motores. Ele detalha o processo de cultura dos NPCs em uma placa de cultura revestida usando meios especializados enriquecidos com inibidores específicos destinados a facilitar a diferenciação de NPCs em neurônios motores maduros.

Protocolo

1. Descongelamento de culturas de células progenitoras neurais (NPC)

1. Cubra as placas de 10 cm com poliornitina (PLO) e laminina no dia anterior ao descongelamento das células.
   1. Adicione 5 mL de PLO diluído a 100 μg / mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou água destilada (dH₂O) às placas. Incubar a 37 °C durante um mínimo de 1 h até uma noite.
   2. Aspire a solução de PLO e enxágue as placas três vezes com PBS. (PLO é tóxico se não for lavado adequadamente.)
   3. Adicionar laminina diluída em PBS a uma concentração de 10 μg/ml às placas revestidas com PLO. Incubar a 37 °C durante um mínimo de 1 h, de preferência durante a noite. Após a incubação, aspire a solução de laminina sem enxaguar para aumentar a adesão celular.
      nota: As placas podem ser revestidas com PLO com antecedência, lavadas três vezes com água, secas em uma capa estéril e armazenadas a 4 °C.
2. Descongele um frasco para injetáveis de NPC contendo 6 x 10⁶ células/frasco para cada placa de cultura de células de 10 cm.
3. Remova o criotubo NPC do nitrogênio líquido e coloque-o imediatamente em banho-maria a 37 °C por até 2 min. Descongele rapidamente agitando o frasco até que haja um pequeno pedaço de gelo cercado por líquido.
4. Transfira os agregados celulares para um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta de 1000 μL e adicione até 15 mL de meio de diferenciação neural (NDM) pré-aquecido ou meio de Eagles modificado de Dulbecco (DMEM) / suplemento F21 F12 de Ham para diluir o dimetilsulfóxido (DMSO).
5. Centrifugue a 300 x g por 5 min.
6. Aspire o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular com meio de diferenciação do neurônio motor (MN) (Tabela 1) + ROCK-I (20 μM) e use uma pipeta de 1000 μL para triturar para cima e para baixo até obter uma única suspensão celular (até 5 vezes).
7. Transferir a suspensão unicelular para uma placa de 10 cm revestida com PLO-Laminina.
8. Transfira a placa para uma incubadora e deixe-a intacta durante a noite para permitir a adesão celular adequada

2. Diferenciando NPC da medula espinhal em neurônios motores

1. Execute as etapas iniciais conforme mencionado nas etapas 1.1-1.8, com o meio final sendo o meio de diferenciação MN + ROCK-I (20 μM).
2. No dia seguinte ao revestimento, execute uma troca completa do meio pelo meio de diferenciação MN sem ROCK-I e, em seguida, troque o meio a cada dois dias. No fim de semana, alimente as células na sexta-feira e novamente na segunda-feira. Enxágue as células com PBS quando necessário para remover os detritos celulares.
3. Troque o meio com meio de diferenciação MN + citosina arabinosídeo (ARA-C) (0,02 μM) e incube por 48 h quando os progenitores gliais comprometidos emergem como células planas de proliferação única sob progenitores MN pós-mitóticos agregados em aglomerados de células.
   nota: Normalmente, isso ocorre nos primeiros 7 dias após o plaqueamento inicial, embora possa haver variabilidade dependendo da linhagem celular.
4. Após 48 h, aspirar o meio contendo ARA-C, enxaguar as culturas suavemente com PBS três vezes e mudar o meio para meio MN fresco sem ARA-C.
5. Após o tratamento com ARA-C, realize trocas de meio em dias alternados (ou segunda, quarta e sexta-feira) removendo o meio antigo com uma pipeta manual em vez de um aspirador a vácuo para evitar o descolamento prematuro dos aglomerados neuronais. Além disso, enriqueça o meio MN com Laminina 1 μg/mL uma vez por semana para aumentar ainda mais a ligação neuronal às placas de cultura.

Tabela 1: Meios de cultura

Nome médio	Reagentes	Concentrações
Meio de diferenciação neural (NDM)	Neurobasal L-Glutamina Aminoácidos não essenciais Suplemento N - N2 Suplemento Penicilina/estreptomicina	1x 100x 100x 100x 100x
Meio de diferenciação de neurônios motores	Meio de diferenciação neural Ácido ascórbico Puromorfamina Fator neurotrófico derivado do cérebro Fator neurotrófico ciliar Fator de crescimento semelhante à insulina 1 Fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais Ácido retinóico Composto E Suplemento B - Suplemento B27	1x 0,4 μg/mL 1 μM 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 1 μM 125 nM 50x

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura estéreis de 10 cm	falcão	353003
Aminoácidos não essenciais (NEAA)	Thermofisher	11140050	Concentração de trabalho 100x
Suplemento N - Suplemento N2	Thermofisher	17502048	Concentração de trabalho 100x
L-Glutamina	Thermofisher	25030	Concentração de trabalho 100x
Neurobasal	Thermofisher	21103049	Concentração de trabalho 1x
Ácido retinóico (AR)	sigma	R2625	Dissolva 100 mg em 3,3 ml de DMSO para obter uma solução de reserva a 100 mM. Alíquota do estoque 100 μL / tubo e congelar a -80 ºC. Pegue 200 μL de estoque de 100 mM e dilua 10x (adicione 1,8 mL de DMSO) para fazer estoque de 10 mM. Alíquota 50 μL/tubo e conservar a -80 ° C. Diluir a 1:10000 para utilização. (concentração de trabalho 2 μM).
Poliornitina (OLP)	Sigma-Aldrich	Pág. 3655	Dissolva 100 mg em 1 mL de ddW para obter 100 mg / mL de solução estoque. Alíquota do estoque em tubos de 100 μL. (concentração de trabalho 100 μg/mL)
Laminina	Thermofisher	Rolamento 23017-015	Solução de estoque 1 mg/mL, concentração de trabalho 10 μg/mL (revestimento), 1 μg/mL (meio celular)
Ácido ascórbico (ASAC)	sigma	Rolamento A4403	Dissolva 100 mg em 250 mL de dH2O para obter 0,4 mg / ml de estoque. Filtrar estéril através de um filtro de 0,22 μm, alíquota e congelar a -80 ºC. Diluir a 1:1000 para utilização. (concentração de trabalho 0,4 μg/mL).
Fator neurotrófico ciliar (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissolva 100 μg em 1 mL de PBS estéril e, em seguida, adicione 9 mL de BSA-PBS estéril a 0,1% a 10 μg/mL. Alíquota e congelar a -80 ° C. Diluir a 1: 1000 para utilização. (concentração de trabalho 10 ng/mL).
Composto E	Abcam	AB142164	Dissolva 250 μg em 2,0387 mL de DMSO para obter um estoque de 250 μM. Alíquota e congelar a -80 ºC. Diluir 1:2000 para uso. (concentração de trabalho 125 nM).
DMEM/F12	Thermofisher	Rolamento 113300	Concentração de trabalho 1x
Neurotrófico derivado de linhagem de células gliais (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolva 100 μg em 1mL de PBS a 100 μg/mL e, em seguida, adicione 9 mL de BSA-PBS estéril a 0,1% a 10 μg/mL. Alíquota e congelar a -80 ° C. Diluir a 1: 1000 para utilização. (concentração de trabalho 10 ng/mL).
Inibidor ROCK-I	Peprotech	1293823	Dissolver 5 mg em 1480 μL de dH2O para obter 10 mM de estoque, alíquota e congelar a -80 ºC. Diluir a 1:500 para uso. (concentração de trabalho 20 μM).
Pencillin/estreptomicina	Thermofisher	15140122	Concentração de trabalho 100x
Purmorlamina (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Dissolva 5 mg em 9,6 mL de DMSO para obter uma solução de 1 mM. Alíquota e congelar a -80 ºC. Diluir 1:1000 para uso. (concentração de trabalho 1 μM).
Fator neurotrófico recombinante derivado do cérebro humano (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifugue brevemente antes da reconstituição. Dissolva 100 μg em 1 mL de PBS a 100 μg/mL e, em seguida, adicione 9 mL de BSA-PBS estéril a 0,1% a 10 μg/mL. Alíquota e congelar a -80 ° C. Diluir a 1: 1000 para utilização. (concentração de trabalho 10 ng/mL).
Fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1)	Sistemas de P&D	291-G1-200	Dissolver 200 μg em 2 ml de PBS a 100 μg/ml, depois adicionar 18 ml de 0,1% BSA-PBS para fazer 10 μg/ml de stock e conservar a -80 ºC. Alíquota e congelar a -80 ºC. Diluir 10 μg/ml de stock a 1:1000 para utilização. (concentração de trabalho 10 ng/mL).
Neurotrófico derivado de linhagem de células gliais (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolva 100 μg em 1mL de PBS a 100 μg/mL e, em seguida, adicione 9 mL de BSA-PBS estéril a 0,1% a 10 μg/mL. Alíquota e congelar a -80 ° C. Diluir a 1: 1000 para utilização. (concentração de trabalho 10 ng/mL).
Ácido retinóico (AR)	sigma	R2625	Dissolva 100 mg em 3,3 ml de DMSO para obter uma solução de reserva a 100 mM. Alíquota do estoque 100 μL / tubo e congelar a -80 ºC. Pegue 200 μL de estoque de 100 mM e dilua 10x (adicione 1,8 mL de DMSO) para fazer estoque de 10 mM. Alíquota 50 μL/tubo e conservar a -80 ° C. Diluir a 1:10000 para utilização. (concentração de trabalho 2 μM).
Composto E	Abcam	AB142164	Dissolva 250 μg em 2,0387 mL de DMSO para obter um estoque de 250 μM. Alíquota e congelar a -80 ºC. Diluir 1:2000 para uso. (concentração de trabalho 125 nM).
Suplemento B - Suplemento B27	Thermofisher	21985023	Concentração de trabalho 50x
Capuzes de cultura de células estéreis	Companhia de Padeiros	SG-600
Centrífuga de cultura de células de mesa	ThermoFisher	75004261	Lenda de Sorvall X1R
Banho-maria	ThermoFisher	2332	Isotemp
Incubadora de cultura celular com umidade controlada	ThermoFisher	370	regulado para 37 °C, 5 % de CO2