Isolando e Cultivando Progenitores de Neurônios Granulares Cerebelares Murinos

Resumo

Fonte: Bovio, P., et al., Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguidos de imunoprecipitação de histona 3 lisina 79 Marca de dimetilação. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o isolamento e o cultivo de células progenitoras neurais cerebelares do cerebelo de um filhote de camundongo. Os progenitores dos neurônios do grânulo cerebelar são isolados e purificados por meio de adesão diferencial, removendo efetivamente os astrócitos. Esses progenitores cultivados subsequentemente se diferenciam em neurônios granulares cerebelares.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Preparativos

1. Preparações para isolamento de CGNP (progenitor de neurônios granulares cerebelares)
   1. Organize um acasalamento apropriado de camundongos para gerar animais P5-P7 para isolar o cerebelo (3-5 animais por ChIP e condição).
   2. Prepare HBSS / glicose adicionando 6 mg / mL de glicose ao tampão HBSS.
   3. Preparar o meio de cultura de células CGNP (CGM) adicionando 1 % (v/v) de suplemento de N2, 1 % (v/v) de penicilina-estreptomicina-neomicina, 25 mM de KCl e 10 % de FCS ao DMEM-F12. Para o cultivo de CGNP, prepare o meio CGM sem FCS, mas incluindo 0,6 μg/mL de ouriço sônico (SHH) (CGM-SHH) e equilibre-o a 37 °C quando necessário.
   4. Cubra as placas de cultura de células de 6 poços com 100 μg/mL de poli-D-lisina por 1-2 h em RT para remoção das células da glia. Em seguida, lave duas vezes com ddH₂O estéril e deixe as placas secarem. Conservar as placas durante no máximo uma semana a 4 °C.
   5. Para o cultivo de CGNPs, cubra as placas de cultura de células de 6 poços com poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) a 4 °C durante a noite. Em seguida, lave duas vezes com H₂O para cultura de células e deixe as placas secarem.
      nota: As placas podem ser armazenadas por no máximo uma semana a 4 °C.
   6. Preparar 0,025% de tripsina (p/v) em HBSS/Glucose e equilibrá-la a 37 °C quando necessário.
2. Isolamento do Progenitor Neural do Tecido Cerebral
   1. Isolamento e cultivo opcional de CGNPs (progenitores de neurônios granulares cerebelares)
      1. Eutanasiar animais P5-7 por decapitação usando tesoura. Remova a pele do couro cabeludo, abra o crânio e remova o cérebro usando uma pequena tesoura e fórceps. Isole o cerebelo e transfira-o para HBSS / glicose gelada. Remova todas as meninges e vasos sanguíneos e transfira o cerebelo para tubos de 15 mL cheios de HBSS / glicose fria.
      2. Lave o cerebelo três vezes com 10 mL de HBSS/glicose gelada (colete-os por centrifugação a 650 x g por 5 min a 4 °C) e homogeneize o cerebelo posteriormente pipetando suavemente para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL (máximo 2-3 vezes) para obter 0,5-1 mm³ fragmentos.
      3. Adicione 5 mL de tripsina a 0,025% em HBSS/Glicose e incube o tecido sob agitação constante em banho-maria a 37 °C por 15 min. Pare a digestão adicionando 5 mL de CGM e colete o tecido por centrifugação a 650 x g por 5 min a 4 °C.
      4. Remova o sobrenadante e triture o tecido com uma ponta pipetável de 1 mL em 1 mL de CGM e transfira-o para um novo tubo de 15 mL.
         nota: É importante evitar bolhas de ar.
         1. Adicione 5 mL de CGM e incube a mistura por 2 min no gelo para assentar os restos de tecido. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml. Adicione 2 mL de CGM ao tecido residual e repita o procedimento de trituração.
      5. Agrupe os sobrenadantes (sem restos de tecido, cerca de 10 mL no total) e centrifugue a 650 x g por 5 min a 4 ° C para coletar as células cerebelares. Ressuspenda o pellet em 10 mL CGM.
      6. Como os astrócitos aderem mais rápido e mais forte à poli-D-lisina do que aos CGNPs, coloque as células em placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina de 100 μg / mL (até 4 mL por poço) e incube por 20 min a 37 ° C para remover os astrócitos.
      7. Agite o prato e recolha o sobrenadante. Em seguida, centrifugue a 650 x g durante 5 min a 4 °C num tubo de 15 ml. Ressuspenda o pellet em 10 mL de CGM e conte as células com uma câmara de contagem de Neubauer.
         nota: Os CGNPs são redondos, pequenos e mostram um halo quando fotografados usando microscopia de contraste de fase.
      8. Se necessário, semeie as células em CGM pré-aquecido a 37 °C em placas revestidas com poli-L-ornitina (3 x 10⁶ células por 6 poços) e incube-as a 37 °C, 5% de CO₂ e 100% de umidade relativa.
         nota: Deixar o CGM nas placas (e com isso o FBS) resultará na diferenciação dos CGNPs em neurônios granulares cerebelares (CGNs).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suplemento B27 (50x)	Tecnologias da Vida	17504044	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para CCM
DMEM-F12	Tecnologias da Vida	11320-033	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para CGM
Soro Fetal Bovino 10% (v/v)	Gibco	10082147	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para isolamento de CPC e CGM
glicose	Sigma-Aldrich	G5767	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para isolamento CGNP
Glutationa (1,25 mg/ml)	Sigma-Aldrich	G4251	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para CCM
glicina	Carl Roth	3187	Categoria: ChIP Abreviatura / Comentário: Para fixação celular
Solução salina balanceada de Hank	Tecnologias da Vida	14025-100	Categoria: Cultura celular Abreviatura / Comentário: HBSS
L-glutamina (200 mM)	Tecnologias da Vida	25030081	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para CCM
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para cultura CPC
Suplemento N2	Tecnologias da Vida	17502048	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para CGM
Meio neurobasal	Gibco	21103049	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para CCM
Penicilina-estreptomicina-neomicina 1% (v/v)	Tecnologias da Vida	15640055	Categoria: Cultura celular Abreviatura/Comentário: PSN, para CCM e CGM
Solução salina tamponada com fosfato	Tecnologias da Vida	10010023	Categoria: Cultura celular Abreviatura / Comentário: PBS, para isolamento CPC
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	Pág. 6407	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para isolamento CGNP
Bromidrato de poli-L-ornitina	Sigma Aldrich	Pág. 3655	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para cultura CPC
Cloreto de potássio	Thermo Fisher	AM9640G	Categoria: Cultura celular Abreviatura / Comentário: KCl, para CGM
Sonic hedgehock (SHH)	Sigma-Aldrich	SRP6004	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para isolamento CGNP
Superóxido dismutase (1mg/ml)	Sigma-Aldrich	S7571	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para CCM
Tripsina-EDTA 0,05% (p/v)	Sigma Aldrich	Rolamento 59417C	Categoria: Cultura celular Abreviação/Comentário: Para isolamento de CPC