Isolando e Cultivando Progenitores de Neurônios Granulares Cerebelares Murinos

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Preparativos

1. Preparações para isolamento de CGNP (progenitor de neurônios granulares cerebelares)
   1. Organize um acasalamento apropriado de camundongos para gerar animais P5-P7 para isolar o cerebelo (3-5 animais por ChIP e condição).
   2. Prepare HBSS / glicose adicionando 6 mg / mL de glicose ao tampão HBSS.
   3. Preparar o meio de cultura de células CGNP (CGM) adicionando 1 % (v/v) de suplemento de N2, 1 % (v/v) de penicilina-estreptomicina-neomicina, 25 mM de KCl e 10 % de FCS ao DMEM-F12. Para o cultivo de CGNP, prepare o meio CGM sem FCS, mas incluindo 0,6 μg/mL de ouriço sônico (SHH) (CGM-SHH) e equilibre-o a 37 °C quando necessário.
   4. Cubra as placas de cultura de células de 6 poços com 100 μg/mL de poli-D-lisina por 1-2 h em RT para remoção das células da glia. Em seguida, lave duas vezes com ddH₂O estéril e deixe as placas secarem. Conservar as placas durante no máximo uma semana a 4 °C.
   5. Para o cultivo de CGNPs, cubra as placas de cultura de células de 6 poços com poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) a 4 °C durante a noite. Em seguida, lave duas vezes com H₂O para cultura de células e deixe as placas secarem.
      nota: As placas podem ser armazenadas por no máximo uma semana a 4 °C.
   6. Preparar 0,025% de tripsina (p/v) em HBSS/Glucose e equilibrá-la a 37 °C quando necessário.
2. Isolamento do Progenitor Neural do Tecido Cerebral
   1. Isolamento e cultivo opcional de CGNPs (progenitores de neurônios granulares cerebelares)
      1. Eutanasiar animais P5-7 por decapitação usando tesoura. Remova a pele do couro cabeludo, abra o crânio e remova o cérebro usando uma pequena tesoura e fórceps. Isole o cerebelo e transfira-o para HBSS / glicose gelada. Remova todas as meninges e vasos sanguíneos e transfira o cerebelo para tubos de 15 mL cheios de HBSS / glicose fria.
      2. Lave o cerebelo três vezes com 10 mL de HBSS/glicose gelada (colete-os por centrifugação a 650 x g por 5 min a 4 °C) e homogeneize o cerebelo posteriormente pipetando suavemente para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL (máximo 2-3 vezes) para obter 0,5-1 mm³ fragmentos.
      3. Adicione 5 mL de tripsina a 0,025% em HBSS/Glicose e incube o tecido sob agitação constante em banho-maria a 37 °C por 15 min. Pare a digestão adicionando 5 mL de CGM e colete o tecido por centrifugação a 650 x g por 5 min a 4 °C.
      4. Remova o sobrenadante e triture o tecido com uma ponta pipetável de 1 mL em 1 mL de CGM e transfira-o para um novo tubo de 15 mL.
         nota: É importante evitar bolhas de ar.
         1. Adicione 5 mL de CGM e incube a mistura por 2 min no gelo para assentar os restos de tecido. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml. Adicione 2 mL de CGM ao tecido residual e repita o procedimento de trituração.
      5. Agrupe os sobrenadantes (sem restos de tecido, cerca de 10 mL no total) e centrifugue a 650 x g por 5 min a 4 ° C para coletar as células cerebelares. Ressuspenda o pellet em 10 mL CGM.
      6. Como os astrócitos aderem mais rápido e mais forte à poli-D-lisina do que aos CGNPs, coloque as células em placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina de 100 μg / mL (até 4 mL por poço) e incube por 20 min a 37 ° C para remover os astrócitos.
      7. Agite o prato e recolha o sobrenadante. Em seguida, centrifugue a 650 x g durante 5 min a 4 °C num tubo de 15 ml. Ressuspenda o pellet em 10 mL de CGM e conte as células com uma câmara de contagem de Neubauer.
         nota: Os CGNPs são redondos, pequenos e mostram um halo quando fotografados usando microscopia de contraste de fase.
      8. Se necessário, semeie as células em CGM pré-aquecido a 37 °C em placas revestidas com poli-L-ornitina (3 x 10⁶ células por 6 poços) e incube-as a 37 °C, 5% de CO₂ e 100% de umidade relativa.
         nota: Deixar o CGM nas placas (e com isso o FBS) resultará na diferenciação dos CGNPs em neurônios granulares cerebelares (CGNs).