1. Geração de organoides cerebrais corticais (Figura 1)
NOTA: Todas as etapas desta seção do protocolo ocorrerão em um capuz de biossegurança Classe 2, salvo indicação em contrário.
- Indução de colônias neuroectodérmicas 2D de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) Cultura 2D (Dias -1 a 3)
- Antes da indução, coloque as colônias de hPSC em uma matriz de membrana basal qualificada com células-tronco embrionárias humanas (hESC) em uma placa de 6 poços com densidade de 20% a 30%. Alcance essa densidade passando colônias de hPSC de um poço de uma placa de 6 poços a 60% de confluência em três poços de uma placa de 6 poços.
- Para revestimento de matriz de membrana basal, dilua a matriz de membrana basal na proporção de 1:50 em um meio basal simples. Deposite uniformemente 1 mL / poço de uma placa de 6 poços, incube por 1 hora em temperatura ambiente (RT) e depois aspire.
- Mantenha as colônias de hPSC por 1 dia em 2 mL de um meio de cultura de células sem soro antes da diferenciação.
- No dia da diferenciação de hPSC, inspecione as colônias de hPSC usando microscopia de campo claro com ampliação de 4x a 10x para garantir colônias saudáveis sem diferenciação detectável.
nota: As hPSCs saudáveis formarão colônias de borda apertada com células que possuem um núcleo grande, citoplasma muito pequeno e nucléolos proeminentes. As colônias iPSC diferenciadas exibirão diferenças morfológicas claras em relação às colônias hPSC descritas acima, particularmente nas bordas externas das colônias ou no centro.
- Adicione os reagentes listados na Tabela 1 para perfazer o meio N2 necessário para a diferenciação. Leve este meio ao RT antes de usar.
- Uma vez em RT, aspirar o meio de cultura de células isento de soro de cada alvéolo da placa de 6 poços e substituí-lo por 2 ml de meio N2 suavemente adicionado com uma pipeta serológica de 5 ml.
- Adicione o supressor duplo de mães contra inibidores decapentaplégicos (SMAD), SB-431542 (10 μM) e LDN 193189 (100 nM).
nota: Os inibidores de SMAD podem ser adicionados ao meio N2 após o meio ter sido colocado em cada poço ou à quantidade necessária de meio N2 antes de substituir o meio de cultura celular isento de soro. Os inibidores podem ser incorporados uniformemente ao meio girando suavemente a placa ou invertendo o tubo que contém o meio e os inibidores 3-4 vezes.
- Adicione meio N2 fresco suplementado com SB-431542 (10 μM) e LDN 193189 (100 nM) diariamente a cada poço pelos próximos 2 dias.
nota: O meio N2 fresco é adicionado para reduzir a exposição prolongada das células ao dimetilsulfóxido (DMSO) que é usado para dissolver os compostos SB-431542 e LDN 193189 e prevenir a citotoxicidade.
- Geração de esferoides neuroectodérmicos 3D a partir de colônias neuroectodérmicas 2D induzidas (dias 3 a 7)
- Levante as colônias neuroectodérmicas induzidas usando dispase seguindo as etapas 1.2.2-1.2.8.
- Primeiro, remova 2 mL de meio N2 da placa de 6 poços e lave 1x com HBSS para garantir que todo o meio N2 seja removido.
nota: O meio N2 pode interferir na atividade enzimática da dispersão, impedindo o desprendimento adequado das colônias neuroectodérmicas do poço.
- Adicione 1 mL de dispase de 2,4 unidades/mL a cada poço contendo colônias.
- Incubar o poço por 20-25 min (máximo 30 min) a 37 °C. Verifique regularmente o desprendimento da colônia.
nota: Pequenas colônias podem se desprender em 20 minutos. Quaisquer colônias que permanecerem presas após 30 minutos devem ser ignoradas.
- Após a incubação, adicione 1 mL de meio N2 ao poço para interromper a atividade da enzima dispase e transfira as colônias para um tubo de 15 mL usando uma ponta de pipeta P1000 de diâmetro largo ou uma ponta de pipeta P1000 modificada cortada com tesoura estéril (tornando-a uma ponta P1000 de diâmetro largo).
- Permita que os aglomerados de colônias afundem no fundo do tubo com gravidade.
nota: Este processo levará aproximadamente 1 minuto.
- Uma vez que os aglomerados tenham afundado, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma ponta de pipeta P1000 padrão e substitua-o por 1 mL de meio N2 fresco. Repita esta etapa de lavagem três vezes para garantir a remoção completa do dispase.
nota: Qualquer dispase remanescente impedirá uma formação uniforme de esferóides neuroectodérmicos e induzirá a morte celular.
- Após a lavagem, ressuspenda os aglomerados celulares em 3 mL de meio N2, transfira para um poço de uma placa de 6 poços e adicione 40 ng/mL de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF).
nota: Se um grande número de colônias neuroectodérmicas fosse destacado, essas colônias poderiam ser plaqueadas em dois ou mais poços de uma placa de 6 poços para evitar a fusão de esferoides. 24 h após o desprendimento das colônias, verifique se os esferóides se formaram.
- Mantenha os esferoides no mesmo meio pelos próximos 3-4 dias, mas adicione bFGF fresco (40 ng/mL) a cada poço diariamente para promover a proliferação de células neuroectodérmicas, auto-organização e induzir e expandir neuroepitelia.
nota: Se os esferoides tiverem sido plaqueados em uma densidade mais alta, é provável que o meio fique amarelo e exija substituição a cada 2 dias por bFGF fresco (40 ng/mL). No entanto, isso não é recomendado e, em vez disso, um número menor de esferoides deve ser mantido em cada poço para evitar esse problema. Os esferoides podem ser incorporados na matriz da membrana basal após 3 dias se os neuroepitelios forem evidentes. Se os neuroepitelios não forem evidentes ou não parecerem fortes, mantenha os esferóides por mais um dia e verifique novamente.
Tabela 1: N2 Médio. A tabela lista os reagentes necessários para preparar o meio N2.
| Componentes de mídia | concentração |
| DMEM Mistura de nutrientes F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) | |
| Suplemento N2 5 mL (100x) | Complementado em 1% |
| B 27 Suplemento 10 mL | Suplementado a 2% |
| Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (100x) | Suplementado a 1% |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | Suplementado a 1% |
| 2-Mercaptoetanol 50 mL (1000x) | Suplementado a 0,1% |
