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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação de material de dissecação, meios de cultura, dispositivos microfluídicos
- Pinça e tesoura de microdissecção em autoclave (121 °C, tempo de esterilização: 20 min) e armazene-as em um recipiente estéril.
- Esterilizar lamínulas de vidro (24 mm x 24 mm) incubando-as em HCl 1 M durante 24 horas num agitador orbital a 37 °C. Lavá-las três vezes com H2O destilado estéril e três vezes com etanol a 99%. Em seguida, secar as lamínulas a 37 °C ou sob uma coifa de fluxo estéril. Por fim, autoclave ou exponha as lamínulas à luz UV (30 min) para completar a esterilização. As lamínulas podem então ser armazenadas em etanol 70%.
- Usando uma pinça estéril, remova cuidadosamente os dispositivos de isolamento de axônio AXIS da embalagem e coloque-os em uma placa de Petri estéril.
- Usando um punção de biópsia estéril (ø: 1mm) crie um orifício por amostra a ser cultivada (Figura 1) em correspondência com as câmaras de cultura.
nota: Não perfure muito perto das microranhuras, pois elas podem ser danificadas pela pressão aplicada.
- Esterilize os dispositivos de isolamento de axônio AXIS imergindo-os em etanol 70%. Em seguida, seque completamente os dispositivos de isolamento de axônio AXIS e as lamínulas sob uma capa de fluxo estéril. Aguarde no mínimo 3 horas antes de prosseguir.
nota: A secagem incompleta resultará na montagem defeituosa dos dispositivos microfluídicos.
- Coloque cada lamínula em uma placa de Petri de 35 mm ou em um poço dentro de uma placa de 6 poços.
- Coloque o dispositivo de isolamento de axônio AXIS na lamínula e pressione suavemente, mas com firmeza, com uma pinça com extremidades dobradas para permitir a adesão total entre o dispositivo de isolamento e a lamínula de vidro.
- Em cada câmara de cultura, pipetar 150 μl de poli-D-lisina (0,1 mg/ml em H2O estéril e destilado). Coloque os dispositivos microfluídicos sob vácuo por 5 min, para remover todo o ar das câmaras de cultura.
- Se o ar ainda puder ser visto dentro das câmaras, pipete novamente a solução de poli-D-lisina para dentro das câmaras.
- Incubar os dispositivos com poli-D-lisina O/N a 37 °C.
- Lave as câmaras três vezes com H2O estéril e destilado.
- Encher as câmaras com 150 μl de solução de trabalho de laminina (Sigma-Aldrich, 5 μg/ml, em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou meio isento de soro) e incubar O/N a 37 °C.
- Preparar 50 ml de meio para culturas de gânglios do trigémeo com a seguinte composição: 48 ml de meio neurobasal, 1 ml de B-27, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 5 ng/ml de fator de crescimento nervoso (NGF), 0,25 pM de citosina arabinosídeo.
- Preparar 50 ml de meio para culturas de germes dentários com a seguinte composição: 40 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)-F12, 10 ml de soro fetal bovino (FBS, concentração final: 20%), 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 150 μg/ml de ácido ascórbico.
2. Geração e dissecção de embriões de camundongos
- Determine a idade embrionária com base no tampão vaginal (tampão vaginal: dia de desenvolvimento embrionário 0,5, E0,5) e confirme-o por meio de critérios morfológicos. Para este protocolo, geralmente usamos embriões de camundongo E14.5-E17.5.
- Limpe a área de dissecação e o estereoscópio com etanol 70%.
- Sacrifique a mãe grávida por luxação cervical. Posicione o pescoço do mouse entre o primeiro e o segundo dedos em uma grade e puxe a cauda decisivamente.
- Disseque a pele ao redor da parte inferior do abdômen e abra o abdômen usando uma tesoura. Localize o útero: durante os estágios finais da gravidez, o útero preenche abundantemente a cavidade abdominal.
- Disseque o útero e coloque-o em um tubo cheio de PBS no gelo. Quando no gelo, o tecido pode ser deixado por várias horas. Descarte o cadáver da mãe de acordo com as diretrizes institucionais.
- Disseque os embriões do útero e liberte-os de seus tecidos extraembrionários. Coloque os embriões em PBS no gelo.
- Decapite os embriões com tesoura e separe a mandíbula inferior do resto da cabeça com uma tesoura de microdissecção (Figura 2A). Remova a mandíbula inferior com precisão, sem danificar os gânglios do trigêmeo; Como estes últimos estão localizados nas proximidades da mandíbula inferior, seus danos acidentais são possíveis. Preserve a mandíbula inferior e o resto da cabeça em PBS frio, no gelo.
- Para dissecar os gânglios do trigêmeo (TG), pegue a cabeça e coloque-a em uma placa de Petri de vidro de dissecação, previamente preenchida com PBS frio. Usando a pinça, remova a pele e o crânio. Em seguida, remova o telencéfalo e o cerebelo colocando uma pinça abaixo do telencéfalo e levante; O telencéfalo e o cerebelo se viram, deixando a parte inferior do crânio exposta.
- Localize os gânglios do trigêmeo (Figura 2B). Use uma pinça para separar o TG dos nervos trigeminais. Elimine os restos das projeções do trigêmeo usando as agulhas de dissecção como facas. Coloque o TG dissecado em uma placa de Petri cheia de PBS frio e mantenha-os no gelo.
- Para dissecar os dentes embrionários, coloque a mandíbula inferior, previamente separada do crânio, na placa de Petri de vidro de dissecação, preenchida com PBS frio. Usando agulhas de dissecção como facas, remova a língua e a pele ao redor da mandíbula. Separe as hemimandíbulas esquerda e direita cortando ao longo da linha média da mandíbula. Os germes dentários são facilmente visíveis, conforme mostrado na Figura 2C. Isole os germes dentários usando agulhas de dissecção e remova o excesso de tecidos não dentários. Coloque os germes dentários dissecados em uma placa de Petri cheia de PBS frio e mantenha-os no gelo.
3. Coculturas microfluídicas
- Após a dissecção, remova a laminina dos dispositivos microfluídicos. Encher as câmaras com 200 μl dos respectivos meios.
- Com uma pinça, transfira suavemente o TG dissecado e os germes dentários para os orifícios criados pela punção (Figura 2D). Certifique-se de que os germes dentários não flutuem e que afundem até entrarem em contato com as lamínulas.
- Cultivar as amostras numa incubadora a 37 °C, 5% de CO2.
- Troque o meio de cultura a cada 48 horas. Não esvazie completamente as câmaras e não pipete diretamente para as câmaras de cultura.
O esvaziamento completo das câmaras resultaria na formação de bolhas de ar dentro das câmaras; A pipetagem direta na câmara resultaria em dano axonal. Para evitar esses problemas, remova o meio apontando a pipeta para o lado externo dos poços; Da mesma forma, pipete o meio fresco na lateral dos poços localizados em frente às câmaras.
- As coculturas podem ser facilmente visualizadas por microscopia de lapso de tempo durante o período de cultura e podem ser mantidas por mais de 10 dias.
- Após o período de cultura, lave as câmaras pipetando 150 μl de PBS em um poço por câmara e deixando o PBS fluir através das câmaras três vezes.
- Remover o PBS e fixar as amostras pipetando 150 μl de paraformaldeído a 4% (em PBS) num alvéolo por câmara; incubar a RT durante 15 min. Lavar as câmaras duas vezes com PBS, conforme descrito no ponto 3.6.
- Prossiga com uma análise mais aprofundada.
