NOTA: A Figura 1A, B mostra um esquema do chip de copolímero de olefina cíclica (COC) pré-montado, incluindo as localizações dos canais ou compartimentos principais, poços e microranhuras. O chip compartimentado pode estabelecer microambientes fluídicos distintos dentro de um compartimento, conforme demonstrado pelo isolamento do corante alimentício ( Figura 1C ).
1. Revestimento de chips multicompartimentais para neurônios hSC
NOTA: A Figura 2A mostra uma visão geral dos procedimentos de revestimento.
- Dissolva a poli-L-ornitina em água destilada de grau de cultura de células para fazer 600 μL de solução por chip de uma solução de trabalho de 20 μg / mL.
- Aspire a solução salina tamponada com fosfato (PBS) restante após a preparação dos cavacos dos poços. Ao aspirar, certifique-se de que a ponta da pipeta esteja afastada da abertura do canal.
nota: Os canais microfluídicos devem permanecer preenchidos durante todo este procedimento. Não aspire líquido dos canais/compartimentos, apenas dos poços.
- Carregue 150 μL de solução de trabalho de poli-L-ornitina no poço superior direito. Aguarde 90 segundos ou até que o líquido comece a encher o poço inferior direito. Adicione 150 μL de meio no poço inferior direito e aguarde 5 min para deixar o líquido passar pelas microranhuras.
- Adicione 150 μL de mídia ao poço superior esquerdo. Aguarde 90 s e, em seguida, adicione 150 μL ao poço inferior esquerdo. Envolva o suporte do(s) chip(s) com parafilme e coloque a 4 °C durante a noite.
nota: Em alternativa, coloque a aparas e o suporte a 37 °C durante 1 h.
- Aspire o meio dos poços, garantindo que a ponta da pipeta seja colocada longe da abertura do canal. Adicione 150 μL de água estéril ao poço superior direito. Aguarde 90 s e adicione 150 μL ao poço inferior direito. Aguarde 5 min para deixar o líquido passar pelas microranhuras.
- Adicione 150 μL de água estéril ao poço superior esquerdo, aguarde 90 s e, em seguida, adicione mais 150 μL ao poço inferior esquerdo.
- Repita as etapas 1.5-1.6.
- Descongelar lentamente a laminação entre 2 °C e 8 °C e preparar uma solução de trabalho de 10 μg/ml.
- Carregue 150 μL da solução de trabalho da laminina no poço superior direito. Aguarde 90 segundos ou até que o líquido comece a encher o poço inferior direito. Pipetar 150 μL para o poço inferior direito. Aguarde 5 min para deixar a laminina passar pelos microsulcos.
- Adicione 150 μL de laminina no poço superior esquerdo. Aguarde 90 s e, em seguida, adicione 150 μL ao poço inferior esquerdo. Incubar a pastilha no seu suporte durante 2 h a 37 °C.
- Enxágue o chip com PBS (sem Ca2+ e Mg2+). Carregue 150 μL de PBS no poço superior direito. Aguarde 90 segundos ou até que o líquido comece a encher o poço inferior direito. Adicione 150 μL de PBS ao poço inferior direito e aguarde 5 minutos para deixar o PBS passar pelas microranhuras.
- Pipetar 150 μL de PBS para o poço superior esquerdo. Após 90 s, pipetar 150 μL para o poço inferior esquerdo.
- Aspire PBS do chip e depois enxágue o chip com meio NSC (consulte a Tabela de Materiais). Carregue 150 μL de mídia no poço superior direito. Após 90 s ou quando o líquido passar pelo canal direito para o poço inferior direito, adicione 150 μL ao poço inferior direito. Aguarde 5 minutos para deixar a mídia fluir pelas microranhuras.
- Adicione 150 μL de mídia ao poço superior esquerdo e outros 150 μL ao poço inferior esquerdo. Incube o cavaco em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 para pré-condicionar o cavaco até que esteja pronto para semear NSCs.
nota: Os chips podem ser pré-condicionados durante a noite, se necessário.
2. Semeando NSCs no chip multicompartimento
NOTA: Este protocolo usou NSCs comprados comercialmente, ao contrário de nossa publicação anterior, que começou com células-tronco embrionárias humanas. Neste protocolo, as células-tronco neurais são colocadas diretamente nos chips de plástico, onde se diferenciam em neurônios. As células podem proliferar como NSCs (sem diferenciação) por até 2 passagens e armazenadas em frascos em N2 líquido para uso posterior. Este protocolo usa frascos NSC armazenados em líquido N2 após a passagem 1 ou 2. A Figura 2B mostra uma visão geral dos procedimentos de revestimento.
- Descongele os NSCs de acordo com as instruções do fabricante.
nota: Este procedimento se aplica a NSCs derivados de H9. Outras linhagens celulares exigirão otimização da densidade celular.
- Conte a concentração de células usando um hemocitômetro e ajuste usando o meio NSC para obter uma concentração de 7 x 106 células por mL.
- Aspire o meio de cada poço do chip. Evite aspirar mídia dos canais principais.
- Pipetar 5 μL da solução celular para o poço superior direito, seguido de 5 μL para o poço inferior direito (70.000 células no total). Certifique-se de que as células estejam pipetadas em direção às aberturas do canal principal. Use um microscópio para verificar se as células entraram no canal. Aguarde 5 min para que as células adiram à parte inferior do chip.
nota: Um ou ambos os compartimentos podem ser usados para carregar células.
- Pipetar ~ 150 μL de mídia NSC para o poço superior direito e, em seguida, 150 μL para o poço inferior direito. Repita no lado esquerdo. Incubar a 5% de CO2, 37 °C dentro de um recipiente umidificado adequado.
- Após 48 horas, aspire o meio NSC dos poços e substitua-o por meio de diferenciação neural adicionando 150 μL a cada poço superior e a cada poço inferior.
- Neurônios de cultura dentro de uma incubadora de CO2 a 5%, 37 ° C dentro de um recipiente umidificado adequado.
