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1. Preparação de Soluções
- Prepare a solução de dissociação tecidual feita de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) contendo vermelho de fenol estéril com papaína (100 U / ml), cisteína (0,2 mg / ml) e desoxirribonuclease (DNase, 250 U / ml).
- Para preparar a solução de DNase, diluir 100 mg do pó liofilizado de DNase I (um frasco) em 50 mL de H2O. Misturar bem e filtrar a solução de reserva. Prepare alíquotas de estoque de 10 mL. Divida um tubo de estoque em alíquotas de uso único de 0,5 mL. Armazenar estas alíquotas de utilização única a -80 °C.
- Preparar os reagentes de separação magnética preparando o tampão da coluna magnética X: solução de albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 2 mM.
- Para preparar meios de neuroesfera, use um meio neurobasal contendo penicilina / estreptomicina com L-glutamina e suplemente com 2% de B27, 20 ng / mL de fator de crescimento epidérmico recombinante humano (EGF) e 20 ng / mL de fator de crescimento de fibroblastos básicos recombinantes humanos (bFGF).
- Para preparar meios de diferenciação, use um meio neurobasal e suplemente com fator diferenciado de 10 ng/mL de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-AA) ou fator inibidor de leucemia de 10 ng/mL (LIF) e 2% de B27.
- Use placas de cultura de fixação ultrabaixa de 12 poços (3,5 cm2) e 6 poços (9,6 cm2).
2. Dissecção do cerebelo
- Anestesiar filhotes de camundongos (P3-P7) com isoflurano e decapitar com tesoura cirúrgica.
- Pulverize as cabeças separadas dos filhotes com etanol a 70%.
- Transfira cada cabeça para uma placa de cultura estéril vazia de 10 cm. Separe a pele usando uma tesoura de microdissecção e, em seguida, remova o crânio passando a tesoura sagital ao longo da linha média.
- Usando uma pinça # 7, retire os ossos do crânio começando caudalmente a partir do tronco encefálico. Levante cuidadosamente o cérebro usando uma espátula, mantendo o cerebelo intacto, e transfira o cérebro para um prato fresco e estéril de 10,0 cm contendo 15 mL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS) gelada.
- Coloque o prato contendo o cérebro sob um microscópio de dissecação. Usando uma pinça fina # 5, remova as meninges e os grandes vasos sanguíneos do cerebelo e separe o cerebelo do tronco encefálico usando a espátula.
- Transfira o cerebelo para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 5,0 mL de solução de HBSS gelada. Lave o cerebelo enxaguando e decantando 3x com 5,0 mL de HBSS.
nota: Cada cerebelo deve ser colocado em seu próprio tubo para processamento posterior.
3. Preparação da Suspensão Celular
- Coloque o prato contendo o cérebro sob um microscópio de dissecação. Usando uma pinça fina # 5, remova as meninges e os grandes vasos sanguíneos do cerebelo e separe o cerebelo do tronco encefálico usando a espátula.
- Transfira o cerebelo para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 5,0 mL de solução de HBSS gelada. Lave o cerebelo enxaguando e decantando 3x com 5,0 mL de HBSS.
nota: Cada cerebelo deve ser colocado em seu próprio tubo para processamento posterior.
- Após o último enxágue, adicione 5 mL de solução de dissociação de tecido à base de papaína que foi pré-aquecida a 37 °C. Incube o tecido por 15 min a 37 °C em banho-maria. Misture lentamente o conteúdo invertendo o tubo para cima e para baixo 3x–5x a cada 3 minutos usando um misturador de nutação ou manualmente.
- Prepare uma pipeta Pasteur de diâmetro largo (pipeta de vidro comum) e de diâmetro estreito (polida a fogo por aquecimento em um bico de Bunsen) conforme descrito anteriormente.
- Lavar o tecido 3x com 5 mL de solução de HBSS, evitando a perda do tecido durante a decantação manual.
- Remova a última lavagem de HBSS e adicione 5 mL de solução de DPBS contendo 250 μL de solução de DNase ao tecido. Dissocie o tecido triturando 10x–15x usando a pipeta Pasteur de diâmetro largo. Execute esta etapa suavemente para evitar a formação de bolhas.
- Em seguida, incubar a pasta por mais 10 minutos a 37 °C no banho-maria, misturando invertendo e endireitando o tubo.
- Use a pipeta Pasteur de diâmetro reduzido para triturar ainda mais a pasta de tecido 10x. Se restarem grandes pedaços de tecido, pressione os pedaços de tecido contra o fundo do tubo com a ponta da pipeta suavemente e continue pipetando até que as células atinjam uma suspensão fina.
- Incubar o tecido a 37 °C durante mais 10 minutos, repetindo os passos de mistura anteriores.
4. Imunomarcação de células-tronco
- Coloque os tubos da centrífuga no gelo e use soluções geladas para as próximas etapas. Coe as células dissociadas através de um filtro de células de 40 μm para um tubo de centrifugação de 50 mL. Cubra o filtro com 10,0 mL de solução HBSS para garantir que as células passem pela malha nesta solução adicional.
- Transferir as células filtradas para um novo tubo de centrifugação de 15 ml e centrifugar a suspensão celular a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar e eliminar completamente o sobrenadante utilizando cuidadosamente um aspirador de vácuo.
- Ressuspenda o pellet em 160 μL de tampão de coluna magnética. Para obter a suspensão de célula única antes da marcação magnética, passe as células por uma malha de náilon de 30 μm para remover aglomerados de células, que podem entupir a coluna.
- Adicione 40 μL de microesferas anti-prominina-1 a cada tubo de 15 mL, misture e incube em uma geladeira por 15 minutos para que o anticorpo se ligue às células que expressam proeminina-1.
- Lave as células adicionando 1,0–2,0 mL de tampão de coluna X e centrifugue a 300 x g por 10 min. Aspire o sobrenadante completamente.
- Ressuspenda o pellet em 1,0 mL de buffer de coluna X.
nota: Se pequenos aglomerados forem observados após a ressuspensão do pellet com 1,0 mL de tampão de coluna X, eles devem ser removidos cuidadosamente usando a ponta da pipeta de Pasteur, caso contrário, esses aglomerados podem bloquear a coluna magnética durante a classificação das células.
5. Preparação da Coluna Magnética, Classificação de Células e Revestimento
NOTA: A separação magnética de diferentes condições de genótipo (doença vs. controle) deve ser realizada ao mesmo tempo, pois qualquer atraso pode afetar a morfologia da neuroesfera.
- Prepare as colunas magnéticas colocando-as no suporte magnético exposto ao campo magnético. Enxágue a coluna uma vez com 500 μL de tampão X aplicando tampão que goteja em um tubo de centrífuga para ser descartado.
nota: Preparar um novo tampão X da coluna magnética para cada experiência; Caso contrário, o rendimento das células-tronco será baixo.
- Aplique a suspensão de célula rotulada na coluna. Colete o fluxo contendo células não marcadas que consistem principalmente em células mistas neuronais / gliais cerebelares em tubos frescos de 15 mL ( Figura 1A ).
- Lave a coluna 3x com 500 μL de tampão X (cada lavagem leva cerca de 2 a 4 min).
nota: A cultura mista neuronal/glial cerebelar enriquecida com neurônios granulares cerebelares pode servir como um subproduto útil dessa etapa de purificação.
- Remova a coluna do campo magnético e coloque-a em um tubo de 1,5 mL. Adicione 1,0 mL de meio de cultura (meio neuroesfera) à coluna e empurre o êmbolo para dentro da coluna para liberar as células marcadas com grânulos de prominina-1 em um tubo de falcão fresco de 1,5 mL.
- Para aumentar a pureza das células marcadas com prominina-1, passe as células eluídas sobre uma segunda coluna seguindo as etapas 5.1 a 5.4.
- Conte as células com um hemocitômetro. O rendimento típico é de 10a 7 células por cerebelo. Coloque as células em placas de fixação ultrabaixas (6 ou 12 poços, com base na densidade necessária para experimentos a jusante).
6. Passagem de Neuroesferas e Diferenciação
- Coloque as células-tronco marcadas com prominina-1 em placas de 12 poços de fixação ultrabaixa em meio neurosfera (5.000 células/poço).
- Após 7 a 10 dias, as células se dividem para produzir neuroesferas flutuantes em forma de bola (neuroesferas primárias).
nota: Neste experimento, neuroesferas secundárias que se expandem em número são geradas para uso posterior. As populações primárias de neuroesferas não são usadas para esses experimentos, pois podem conter células contaminantes que não possuem propriedades de células-tronco e podem se aglomerar junto com as neuroesferas.
- Para a passagem, transfira as neuroesferas primárias junto com os meios de cultura usando pontas de pipeta de 1,0 mL para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Pulverizar as neuroesferas por centrifugação a 300 x g durante 5 min e rejeitar o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet em 5 mL de meio de dissociação tecidual que contenha papaína ou solução de tripsina a 0,05%. Incubar a 37 °C durante 10 min.
- Centrifugue a suspensão celular a 300 x g por 5 min. Ressuspenda as células em 5 mL de meio neuroesférico e dissocie as células mecanicamente usando uma pipeta de plástico Pasteur e pipetando lentamente para cima e para baixo 10x.
- Coloque as células (novamente) em meios de neurosfera, conforme descrito anteriormente. Após 7 a 10 dias em cultura, a placa deve ser enriquecida com neuroesferas secundárias.
nota: Essas culturas podem ser passadas até 8x com boa eficiência, após o que o tamanho da neuroesfera tende a ser menor e sugestivo de uma diminuição na proliferação.
- Conte as células no hemocitômetro e coloque o número ideal para experimentos futuros em placas revestidas de poli-D-lisina (6 ou 12 poços).
- Para diferenciar as células-tronco, coletar neuroesferas da segunda à oitava passagem por centrifugação conforme descrito anteriormente, exceto adicionar um meio de diferenciação ao pellet.
nota: Após 7 dias in vitro, as células-tronco se diferenciam em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos, conforme demonstrado pela coloração com o marcador neuronal β-III tubulina, o marcador astrocítico Glial fibrilar ácido
