Cocultura de neurônios ganglionares da retina com glia de revestimento olfativo

Resumo

Fonte: Portela-Lomba, M., et al. Cocultura de neurônios ganglionares retinianos de ratos axotomizados com glia de revestimento olfativo, como um modelo in vitro de regeneração axonal adulta. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar os neurônios ganglionares da retina (RGNs) da retina de um rato e cocultivá-los com células da glia de revestimento olfativo (OEG). Este método permite estudar o potencial neuro-regenerativo dos OEGs após lesão neural.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de ihOEG (Ts12 e Ts14) para o ensaio

NOTA: Esta etapa deve ser feita 24 h antes da dissecção e cocultura do RGN.

1. Trate lamínulas de 12 mm Ø com 10 μg/mL de poli-L-lisina (PLL) por 1 h.
   nota: As lamínulas podem ser deixadas durante a noite na solução PLL.
2. Lave as lamínulas com 1x tampão fosfato salino (PBS) três vezes.
3. Separe as células Ts12 e Ts14 ihOEG da placa de cultura de células p60.
   1. Adicione 4 mL de meio de cultura DMEM/F12 (meio basal)-FBS (soro fetal bovino) a um tubo cônico de 15 mL. Aquecer a 37 °C em banho-maria limpo.
   2. Remova o meio das placas e lave as células com 1 mL de 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato)-EDTA (ácido etileno diamina tetracético) uma vez.
   3. Adicione 1 mL de tripsina-EDTA às células OEG e incube por 3–5 min a 37 °C, 5% de CO₂.
   4. Colete as células com uma pipeta p1000 e transfira-as para o meio preparado na etapa 2.1.
   5. Centrifugue por 5 min a 200 x g.
   6. Aspire o sobrenadante.
   7. Adicione 1 mL de meio ME10 e ressuspenda o pellet.
   8. Conte o número de células em um hemocitômetro.
4. Semear 80.000 células Ts14 ou 100.000 células Ts12/poço nas lamínulas em placas de 24 poços em 500 μL de meio ME10.
5. Cultivar células a 37 °C em 5% de CO₂ durante 24 h.

2. Dissecção do tecido retiniano

NOTA: Ratos Wistar machos de 2 meses de idade são usados como fonte RGN. Duas retinas (um rato) para 20 poços de um prato de células de 24 poços. Autoclave o material cirúrgico antes do uso. O kit de dissociação de papaína é adquirido comercialmente (Tabela de Materiais). Siga as instruções do provedor para reconstituição. Reconstituir o ácido D, L-2-amino-5-fosfonovalérico (APV) em massa 5 mM e preparar as alíquotas.

1. No dia do ensaio, prepare a seguinte mídia.
   1. Prepare uma placa de cultura de células p60 com 5 mL de EBSS frio (solução salina balanceada de Earle) (frasco 1 do kit de dissociação de papaína).
   2. Prepare uma placa de cultura de células p60 com o frasco 2 reconstituído (papaína) do kit de dissociação da papaína mais 50 μL de APV. Em seguida, adicione 250 μL de frasco para injetáveis reconstituído 3 (DNase mais 5 μL de APV).
   3. Em um tubo estéril, misture 2,7 mL do frasco 1 com 300 μL do frasco 4 (inibidor da protease albumina-ovomucóide). Adicione 150 μL de frasco para injetáveis 3 (DNase) mais 30 μL de APV.
   4. Prepare 20 mL de meio Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. Sacrifique um rato por asfixia com CO₂.
3. Remover a cabeça por decapitação com uma guilhotina; colocá-la numa placa de Petri de 100 mm e pulverizar a cabeça com etanol a 70% antes de a colocar numa capela de fluxo laminar.
4. Corte os bigodes do rato com uma tesoura para que não interfiram na manipulação dos olhos.
5. Segure o nervo óptico com uma pinça para puxar o globo ocular o suficiente para poder fazer uma incisão no olho com um bisturi.
6. Remova o cristalino e o humor vítreo e retire a retina (tecido semelhante a laranja) enquanto as camadas restantes do olho (incluindo a camada epitelial pigmentar) permanecem dentro.
7. Colocar a retina na placa de cultura de células p60 preparada no passo 2.1.1.
8. Transferir a retina para a placa de cultura de células p60 preparada no passo 2.1.2 e cortá-la com o bisturi em pequenos pedaços de tamanho aproximado < 1 mm.
9. Transfira para um tubo de plástico de 15 mL.
10. Incubar o tecido por 30 min, em incubadora umidificada a 37 °C sob 5% de CO₂, com agitação a cada 10 min.
11. Dissocie os aglomerados de células pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de vidro Pasteur.
12. Centrifugue a suspensão celular a 200 x g por 5 min.
13. Descarte o sobrenadante. Para inativar a papaína, ressuspenda o pellet celular na solução preparada na etapa 2.1.3 (1,5 mL para 2 olhos).
14. Pipete cuidadosamente esta suspensão celular em 5 mL de frasco reconstituído 4.
15. Centrifugue a 200 x g por 5 min.
16. Durante a centrifugação, remova completamente o meio ME-10 da placa de célula de 24 poços OEG (previamente preparada na etapa 1) e substitua-o por 500 μL de meio NB-B27 por poço.
17. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 ml de meio NB-B27.
18. Placa de 100 μL de suspensão de células da retina, por poço da placa m24, em lamínulas de monocamadas tratadas com PLL ou OEG.
19. Manter as culturas a 37 °C com 5% de CO₂ durante 96 h em meio NB-B27.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suplemento B-27	Gibco	17504044
Ácido D,L-2-amino-5-fosfonovalérico	sigma	283967	Inibidor do receptor NMDA
DMEM-F12	Gibco	11320033	Meio de cultura celular
FBS	Gibco	11573397	Soro fetal bovino
FBS-Hyclone	Fisher Científico	16291082	Soro fetal bovino
L-Glutamina	Lonza	BE17-605F
Meio Neurobasal	Gibco	21103049	Meio de cultura de células neuronais
Sistema de dissociação de papaína	Corporação Bioquímica Worthington	LK003150	Para uso em isolamento de células neurais
Pbs	Feito em casa
PBS-EDTA	Lonza	H3BE02-017F
Penicilina/estreptomicina/anfotericina B	Lonza	17-745E	Bacteriostático e bactericida
Extrato hipofisário	Gibco	13028014	Extrato de hipófise bovina
Poli -L- lisina (PLL)	sigma	A-003-M