Uma técnica para isolar células satélites do tecido muscular da cabeça de rato

Resumo

Fonte: Carvajal Monroy, P. L., et al. Isolamento e Caracterização de Células Satélites dos Músculos Branquiaricos da Cabeça de Rato. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra o isolamento de células satélites dos tecidos musculares branquioéricos da cabeça de rato por meio de dissecção tecidual, digestão enzimática e subsequente purificação mecânica e centrífuga. As células são então semeadas em poços revestidos com matriz extracelular para diferenciação em mioblastos e, eventualmente, em miotubos e fibras musculares maduras.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Manchas de gel de matriz extracelular

1. Execute as seguintes etapas um dia antes do isolamento:
   1. Descongelar uma alíquota de gel de matriz extracelular (100 μl) a 4 °C durante pelo menos 1,5 h. Diluir 1:10 no meio de Eagle modificado de Dulbecco; com 4.500 mg/L de glucose, 4 mM de L-glutamina e 110 mg/ml de piruvato de sódio (DMEM). Mantenha o gel da matriz extracelular a 4 °C o tempo todo.
      NOTA: Mudanças abruptas de temperatura resultarão em revestimento i....

Resultados

Figura 1: Pontos de gel de matriz extracelular em uma lâmina de câmara. (A) Para facilitar a manipulação, coloque a lâmina da câmara de 8 poços em uma placa de Petri de 100 mm. Pipetar 10 μl de gel de matriz extracelular em cada câmara e colocá-lo sobre uma superfície fria (7 min). (B) Deslizamento da câmara após a remoção do excesso de gel da matriz extracelular.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulha hipodérmica 25 g 0,5 x 25 m	BD Microlance	Rolamento 300400
Tesoura de dissecação	Braun	BC154R
Micro fórceps reta	Braun	BD330R
Lâmina de bisturi cirúrgico nº 15	Swann-Morton	0205
Álcool 70%	Denteck	2.010.005
Corrediça Permanox, 8 câmaras	Thermo Científico	177445
Placa de cultura de células de 6 poços	Greiner bio-one	Nº 657160
Placas de Cultura de Células (100 x 20 mm)	Greiner bio-one	Nº 664160
Tubo de centrífuga cônico estéril de 15 ml	BD Biociências	352097
Tubo de centrífuga cônico estéril de 50 ml	BD Biociências	352098
Filtro de células (40 μm)	Gibco	Rolamento 431750
Pipeta serológica de 10 ml	Greiner bio-one	Nº 607180
20 μl FT20	Greiner bio-one	774288
Matrigel, Sem Fenol Vermelho	BD Biociências	356237	10 ml
Pronase	Calbioquímica	Rolamento 53702	10 KU
Solução salina tamponada com fosfato	Gibco	14190-144	500 ml
Meio Eagle Modificado de Dulbecco, glicose alta, suplemento GlutaMAX, piruvato	Gibco	Rolamento 10569-010	500 ml
Soro fetal bovino	Fisher Científico	3600511	500 ml
Soro de Cavalo	Gibco	26050088	500 ml
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml
Extrato de Embrião de Galinha	MP Biomédicos	2850145	20 ml