Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Manchas de gel de matriz extracelular
- Execute as seguintes etapas um dia antes do isolamento:
- Descongelar uma alíquota de gel de matriz extracelular (100 μl) a 4 °C durante pelo menos 1,5 h. Diluir 1:10 no meio de Eagle modificado de Dulbecco; com 4.500 mg/L de glucose, 4 mM de L-glutamina e 110 mg/ml de piruvato de sódio (DMEM). Mantenha o gel da matriz extracelular a 4 °C o tempo todo.
NOTA: Mudanças abruptas de temperatura resultarão em revestimento irregular e formação de cristais.
- Mantenha a solução diluída de gel de matriz extracelular em gelo por 15 min.
- Pré-resfrie uma micropipeta de 20 μl por 10 min.
- Coloque as lâminas da câmara de 8 poços em uma placa de Petri de 100 mm e transfira a placa para uma superfície fria (por exemplo, um freezer) por 10 min.
- Use a micropipeta pré-resfriada para colocar uma gota de 10 μl de gel de matriz extracelular em cada poço. Mantenha a placa de Petri na superfície fria por pelo menos mais 7 min (Figura 1A).
- Remover completamente o gel de matriz extracelular restante (Figura 1B) e secar os alvéolos a 37 °C durante a noite.
2. Dissecção dos músculos da cabeça (masseter, digástrico e elevador do véu palatino)
- Antes da dissecção, prepare 50 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementada com penicilina-estreptomicina a 2% (P/S). Mantenha no gelo.
- Após a eutanásia de um rato adulto jovem (9 semanas) com CO2/O2, decapitar a cabeça e retirar a pele da cabeça. Transfira a cabeça para PBS gelado suplementado com 2% de P/S em um tubo de 50 ml.
- Músculo masseter (derivado do 1º arco branquial)
- Coloque a cabeça com um lado para cima em uma almofada de silicone e fixe-a com agulhas hipodérmicas (Figura 2A).
- Identifique a glândula parótida e o nervo facial (Figura 2A). Exponha a fáscia profunda que cobre a glândula. Corte a fáscia e remova a glândula usando uma tesoura de dissecação. Identifique o canal auditivo externo. Trace o nervo facial a partir do forame estilomastóideo e remova cuidadosamente os ramos temporal, zigomático e bucal com uma lâmina de bisturi nº 15.
- Liberte a cabeça superficial do músculo masseter removendo a fáscia. Identifique as cabeças superficiais e profundas do músculo masseter. Trace a cabeça superficial até que sua aponeurose tendínea espessa seja inserida no processo zigomático da maxila.
- Separe o tendão de sua origem no processo zigomático com uma pinça reta. Corte-o com uma lâmina de bisturi nº 15 ou tesoura de dissecção e levante-o cuidadosamente (Figura 2B).
- Dissecar a cabeça superficial do masseter até sua inserção no ângulo e na metade inferior da superfície lateral do ramo da mandíbula com lâmina de bisturi nº 15 (Figura 2C). Agora, remova completamente o músculo.
- Ventre posterior do músculo digástrico (derivado do 2º arco branquial)
- Coloque a cabeça em decúbito dorsal na almofada de silicone e fixe-a com agulhas hipodérmicas (Figura 3A).
- Remova a gordura subcutânea que cobre as glândulas sublinguais e submandibulares. Em seguida, remova a fáscia superficial e as glândulas usando uma tesoura de dissecação. Exponha o músculo digástrico (ventre anterior e posterior).
- Segure o tendão anterior do ventre posterior com uma pinça reta, corte-o e disseque-o cuidadosamente até que sua origem esteja na bula timpânica (Figura 3B). Faça o mesmo no lado contralateral.
- Músculo elevador do véu palatino (derivado do 4º arco branquial)
- Após a dissecção do ventre posterior do músculo digástrico, localize o músculo estilo-hióideo, puxe-o lateralmente e remova-o cuidadosamente (Figura 4A).
- Localize o tendão do elevador do véu palatino que se insere na bula timpânica (Figura 4A). Disseque-o com cuidado e corte-o dos dois lados.
- Procure a traqueia e o esôfago que corre atrás dela. Levante o esôfago e exponha a faringe e a laringe.
- Localize e disseque a área do músculo constritor superior da faringe. Identifique o elevador do véu palatino e corte-o em ambos os lados (Figura 4B).
nota: Diretamente após a dissecção, remova cuidadosamente o tendão e o tecido conjuntivo de cada músculo sob o microscópio estereoscópico. Mergulhe todas as amostras rapidamente em etanol a 70% e transfira-as para PBS gelado suplementado com 2% de P/S em um tubo de 15 ml.
3. Isolamento de Células Satélites (SCs)
- Execute as seguintes etapas de preparação para o isolamento SC dos três grupos musculares:
- Prepare 7,5 ml de pronase a 0,1% em DMEM. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm. Pré-aqueça a solução a 37 °C em banho-maria durante 10 min antes do isolamento.
- Prepare 35 ml de DMEM suplementado com 10% de soro de cavalo (HS) e 1% de P/S. Além disso, pré-aqueça a 37 °C em banho-maria.
- Prepare 15 ml de meio de cultura que consiste em DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS), 10% de HS, 1% de P/S e 1% de extrato de embrião de galinha (CEE). Pré-aquecer a 37 °C em banho-maria.
- Pré-cubra seis pipetas de plástico (10 ml) com HS e seque por pelo menos 10 minutos antes de usar.
- Na capa de cultura, transfira cada músculo para um poço de uma placa de 6 poços. Usando a tesoura de dissecação, corte o músculo em pequenos pedaços de cerca de 2 mm. Tenha cuidado para não picar muito o tecido.
- Adicione cuidadosamente 2,5 ml de solução de pronase a 0,1% em cada poço e incube a 37 °C por 60 min. Agite suavemente a placa após 20, 40 e 60 min.
nota: A duração exata da incubação depende de fatores como a idade e a tensão dos animais.
- Monitore sob o microscópio. Verifique os fragmentos musculares e interrompa a digestão enzimática quando os feixes de fibras parecerem soltos (Figura 5).
- Adicione 2,5 ml de DMEM suplementado com 10% de HS e 1% de P/S. Transfira para um tubo de 15 ml e centrifugue os tubos a 400 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante por decantação.
- Adicione 5 ml de DMEM suplementado com 10% de HS e 1% de P/S. Pipete a solução para cima e para baixo com uma pipeta de plástico de 10 ml (trituração) pelo menos 20 vezes para homogeneizar o tecido.
- Centrifugar os tubos a 200 x g durante 4 min. Recolher o sobrenadante e transferi-lo para um tubo de 15 ml.
- Adicione 5 ml de DMEM suplementado com 10% de HS e 1% de P/S. Pipete novamente com uma pipeta de plástico de 10 ml até que os fragmentos de tecido passem facilmente.
- Centrifugar os tubos a 200 x g durante 4 min e recolher o sobrenadante num tubo de 15 ml.
- Colocar um filtro de células (40 μm) num tubo de 50 ml e transferir o sobrenadante que contém as células dissociadas para o filtro. Lavar com 1 ml de DMEM para uma recuperação celular máxima.
- Centrifugue os tubos a 1.000 x g por 10 min e descarte o sobrenadante com uma pipeta.
- Ressuspenda o pellet em meio de cultura de 300 μl e conte as células em um hemocitômetro.
4. Diferenciação de células satélites em manchas de gel de matriz extracelular
- Diluir a suspensão celular para obter 1,5 x 103 células em 10 μl de meio de cultura.
- Prenda as tampas das lâminas da câmara com fita adesiva e marque as manchas com um marcador preto na parte inferior do objeto de vidro.
- Usando uma micropipeta, coloque uma gota de 10 μl de suspensão celular no ponto de gel da matriz extracelular. Verifique ao microscópio se a gota de suspensão celular foi colocada corretamente no local. Incubar durante seis horas a 37 °C.
- Adicione cuidadosamente 400 μl de meio de cultura (DMEM suplementado com 20% de FBS, 10% de HS, 1% de P/S e 1% de CEE) e incube por três dias a 37 °C.
nota: Neste ponto, os SC recém-isolados são submetidos a traumas maciços (digestão enzimática e trituração severa) e precisam se recuperar. Não perturbe as células durante os primeiros três dias. Em seguida, o meio de cultura pode ser alterado dependendo do tipo de experimento.
Os pontos de gel de matriz extracelular podem ser semeados com uma alta densidade celular (1,5-2,5 x 103/20 μl) para ensaio de diferenciação. O meio de cultura (DMEM suplementado com 20% de FBS, 10% de HS, 1% de P/S e 1% de extrato de embrião de galinha) pode ser substituído a cada três dias.
