Neurogênese induzida por ácido retinóico usando células de carcinoma embrionário de camundongo

Resumo

Fonte: Leszczyński, P., et al., Neurogênese usando células de carcinoma embrionário P19 J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra uma técnica simples para neurogênese induzida por ácido retinóico em células de carcinoma embrionário de camundongo P19. O ácido retinóico ativa fatores de transcrição e desencadeia a expressão gênica para diferenciação neuronal.

Protocolo

1. Geração de agregação

1. Adicionar 5 μL de AR (ácido retinóico) (estoque de 1 mM dissolvido em etanol a 99,8%, armazenado a -20 °C) aos 10 mL de meio de diferenciação e misturar bem (concentração final de 0,5 μM de RA).
   nota: A AR é sensível à luz. Uma baixa concentração de etanol não afeta a diferenciação celular.
2. Adicione 10 mL de meio de diferenciação (com RA) à placa de cultura não tratada de 100 mm (dedicada à cultura em suspensão).
3. Semeie as células 1 x 10⁶ no prato de 100 mm (área de superfície do prato 56,5 cm2).
4. Colocar o balão com células na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ durante 2 dias para promover a formação de agregados.
5. Após 2 dias, troque o Meio de Diferenciação. Aspirar o meio contendo agregados usando uma pipeta de 10 mL e transferir para um tubo de 15 mL em RT.
6. Permitir que os agregados assentem por gravidade durante 1,5 min a RT.
7. Descarte o sobrenadante.
8. Adicione 10 mL de meio de diferenciação com 0,5 μM de AR usando uma pipeta sorológica de 10 mL.
   cuidado: Não pipete os agregados de células para cima e para baixo.
9. Semear os agregados numa nova placa de cultura não tratada de 100 mm (dedicada à cultura em suspensão).
10. Coloque a placa na incubadora (a 37 °C e 5% de CO₂) por 2 dias.

2. Dissociação de agregados

1. Aspirar os agregados celulares com uma pipeta de 10 ml.
2. Transferir os agregados para um tubo de 15 ml. Deixe os agregados celulares assentarem por gravidade por 1,5 min.
3. Remova o sobrenadante.
4. Lave os agregados apenas com DMEM (sem soro e sem antibióticos).
5. Permitir que os agregados celulares assentem por sedimentação por gravidade durante 1,5 min a RT.
6. Aspire o sobrenadante e adicione 2 mL de tripsina-EDTA (0,25%).
7. Colocar os agregados celulares num banho-maria (37 °C) durante 10 min. Agitar os agregados suavemente de 2 em 2 minutos, batendo com a mão.
8. Pare o processo de tripsinização adicionando 4 mL de meio de manutenção.
9. Pipete os agregados para cima e para baixo 20 vezes usando uma pipeta de 1 mL.
10. Centrifugue as células por 5 min a 200 x g e RT.
11. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 5 mL de meio de manutenção.
12. Determine o número da célula com um contador de células.

3. Células de revestimento

1. Adicione 3 mL por poço de meio de manutenção a uma placa de 6 poços.
2. Células de sementes na placa de cultura de 6 poços a uma densidade de 0,5 x 10⁶/poço.
3. Incubar a 37 °C com concentração de 5% de CO₂.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM glicose alta (4,5 g/L) com L-glutamina	Lonza	BE12-604Q
Etanol 99,8%	Chempur	CHEM*613964202
Soro fetal bovino (FBS)	EURx	E5050-03
Penicilina/Estreptomicina 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 1x concentrado sem íons de cálcio e magnésio	Lonza	BE17- 517Q
Ácido retinóico	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	Dissolvido em etanol a 99,8%; armazenar em -20 °C até 6 meses
Tripsina 0,25% - EDTA em HBSS, sem íons de cálcio e magnésio, com Vermelho de Fenol	Biossoros	LM-T1720/500
Pipetas sorológicas de 1 mL	Profilab	515.01
Pipetas sorológicas de 10 mL	Profilab	515.1
Prato de 100 mm dedicado à cultura de suspensão	Corning	C351029
Tubos de centrífuga de 15 mL	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
Pipetas sorológicas de 5 mL	Profilab	Rolamento 515,05
Placa de 6 poços	Corning	CLS3516
Balões de cultura de células, superfície de 25 cm quadrados	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA