Diferenciando células do corpo embrióide em progenitores neurais usando ácido retinóico

Resumo

Fonte: Yang, J., et al. Análise da Diferenciação Neural Induzida por Ácido Retinóico de Células-Tronco Embrionárias de Camundongo em Corpos Embrióides Bidimensionais e Tridimensionais. J. Vis. (2017).

O vídeo demonstra o método para induzir a diferenciação de células-tronco em progenitores neurais usando ácido retinóico e o método de cultura de gota suspensa.

Protocolo

1. Cultura de fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs)

1. Prepare o meio MEF, meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, alto teor de glicose), suplementado com 15% de soro fetal bovino (FBS).
2. Cubra as placas de cultura de células de 100 mm com solução de gelatina a 0,5% por 30 min em temperatura ambiente (RT).
3. Conte os MEFs usando um citômetro. Remova a solução de gelatina e despeje imediatamente o meio MEF pré-aquecido a 37 ° C. Descongele rapidamente os frascos de MEFs tratados com mitomicina C em banho-maria a 37 ° C por 2 min e, em seguida, semeie 2,8 x 10⁶ MEFs por placa revestida de gelatina de 100 mm. Ajuste o número da célula de acordo se estiver usando pratos de outros tamanhos. Incubar MEFs durante a noite a 37 °C, 5% CO₂.
4. Mude o meio no dia seguinte. Cultura por 2-3 dias até que a camada de MEF seja confluente.

2. Células-tronco embrionárias de camundongo ou cultura ESC

1. Prepare o meio ESC, o meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) suplementado com 15% de FBS e 10³ U / mL de fator inibidor de leucemia (LIF), 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 55 mM de 2-mercaptoetanol, penicilina (100 U / mL), estreptomicina (100 μg / mL), gentamicina (200 μg / mL) e 0,2% de antibiótico micoplasma.
2. Retirar o meio MEF da cápsula preparada no passo 1 e substituí-lo por meio ESC pré-aquecido a 37 °C.
3. Descongele um frasco de ESC e células de sementes no topo da camada de MEF. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂, até que as ESCs atinjam a confluência.
4. Prepare novas placas de cultura de células contendo uma monocamada confluente de MEFs. Para passar as ESCs, lave uma vez com PBS e retire com 0,25% de tripsina / EDTA por 2-5 min a 37 ° C, 5% de CO₂. Pare a tripsinização adicionando IMDM novo com 15% de FBS às células de descolamento, transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL e centrifugue a 160 x g por 5 min em RT.
5. Remova o sobrenadante, ressuspenda as ESCs com IMDM novo e passe um quinto das células para cada nova placa revestida com MEF; incube até que as células atinjam a confluência (normalmente 4-5 dias).

3. Retirar MEFs e cultivar ESCs em placas revestidas de gelatina

1. Assim que os ECSs atingirem a confluência, separe-os e os MEFs com 0,25% de tripsina / EDTA como na etapa 2.4, ressuspenda as células em IMDM fresco, transfira para uma placa de Petri bacteriológica não adesiva e incube por 40 min a 37 ° C, 5% de CO₂.
2. Transfira cuidadosamente ESCs e meios contendo MEFs para uma nova placa revestida de gelatina usando uma pipeta de 5 mL, evitando pipetagem repetida. As células restantes nas placas de Petri são MEFs, uma vez que as ESCs não aderem.
3. Passe os ESCs a cada 3-4 dias. A passagem menos frequente pode reduzir a pluripotência da ESC. Não exceda 60% de confluência, pois pode favorecer a diferenciação.
4. Repita as etapas 3.2-3.3 três vezes ou mais, conforme necessário, até que os MEFs não sejam mais detectáveis por um microscópio de cultura de células, usando uma objetiva de 20X, para garantir que os MEFs não estejam presentes.
5. Verifique a pluripotência ESC verificando a cultura ESC para ver se as células formam colônias densas com morfologia poligonal típica de ESC (Figura 1A). Teste a estaminalidade celular por reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR), immunoblotting ou imunofluorescência de fatores de transcrição de pluripotência central (Figura 2).

4. Formação EB

1. Prepare uma solução estoque totalmente trans-RA a 10 mM em DMSO e aliquota-a em tubos de microcentrífugas protegidos contra luz de 1,5 mL. A solução é estável a -80 °C por até duas semanas. Proteja-o da luz.
2. Tripsinizar ESCs como na etapa 2.4; recolocar em IMDM fresco sem LIF como uma suspensão de célula única.
3. Conte as células usando um hemocitômetro e prepare uma suspensão de 5 x 10⁵ células/mL em IMDM com 0,5 μM de RA.
4. Coloque 100 gotas de 20 μL por placa de Petri de 100 mm com uma pipeta de 8 canais e pontas de 200 μL, inverta os pratos e encha a tampa invertida com PBS para evitar que as gotas penduradas sequem. Proteja os meios de cultura contendo RA da luz.
5. Cultura EBs em gotas suspensas a 37 °C, 5% CO₂, por 4 dias.

Resultados

Figura 1: Emergência de brotos de Syx^+/+ e Syx^-/- EBS em cultura 3D. (A) Syx^+/+ e Syx^-/- ESCs cresceram em colônias agrupadas antes da indução da diferenciação neural. (B e C) imagens de EBs formadas em gotas suspensas com 0,5 μM de RA e, em seguida, inseridas em uma matriz de colágeno 3D sem AR. As imagens foram capturadas no dia 6 pelas objetivas indicada...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
materiais
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	Camada alimentadora ESC
Esc	EMD Millipore	CMTI-2
Placa de cultura de células (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cultura de células
Placa de cultura celular (100 mm)	falcão	353003	Cultura de células
Placa de Petri (100 mm)	Corning	351029	Gotas suspensas
Tubo de centrífuga escuro de 1,5 ml	Produtos Científicos Celltreat	229437	Solução de estoque RA
Tampa de vidro para microscópio	Marca de pescador	12-545-80	Circular, 12 mm de diâmetro
Lâminas de microscópio Superfrost-plus	Marca de pescador	12-550-15
Reagentes
DMEM	Lonza	12-709F	Cultura MEFs
IMDM	Gibco	12440-046	Cultura ESCs
Soro fetal bovino (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	Cultura ESCs
gelatina	Sigma-Aldrich	G2625	Revestimento de louça
Lif	Sistemas de P&D	8878-LF-025	Para manter a pluripotência ESC
Soluções de aminoácidos não essenciais MEM	Gibco	11140050	Cultura de células
2-Mercaptoetanol	Gibco	21985023	Cultura de células
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122	Cultura de células
gentamicina	Gibco	15750060	Cultura de células
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cultura de células
0,25% de tripsina-EDTA	Gibco	Rolamento 25200-072	Cultura de células
Dmso	Sigma-Aldrich	D2650
Ácido totalmente trans-retinóico	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Indução de diferenciação neural
Pbs	Gibco	10010049
Instrumentos
Microscópio de campo amplo	Nikon	Eclipse TS100	Imagiologia de cultura celular