1. Clonagem de lentivetor 2K7
- Antes de clonar o gene de interesse no vetor lentiviral 2K7, subclonar o gene no vetor pENTR (3637 pb, resistente à canamicina) usando técnicas moleculares padrão. Use os locais de restrição EcoRI e SacII para a subclonagem.
- Amplificação do lentivector 2K7
- Transforme o DNA lentivetor 2K7 misturando suavemente 100 ng de DNA de plasmídeo com células competentes e incube no gelo por 30 min.
- Choque térmico DNA / células competentes misturam a 42 ° C por 90 segundos e as plaqueam em placas LB-Agar contendo ampicilina (100 μg / ml) e cloranfenicol (15 μg / ml) a 37 ° C por 16-18 hr.
NOTA: O cloranfenicol é usado para evitar a recombinação entre as longas repetições terminais.
- No dia seguinte, cultive clones bacterianos selecionados em meio Luria-Bertani (LB) contendo ampicilina (100 μg/ml) e cloranfenicol (15 μg/ml) a 37 °C por 16-18 horas. Extraia o DNA usando um kit comercial de DNA Maxiprep de acordo com as instruções do fabricante.
- Subclonagem do vetor pENTR para o lentivetor 2K7 (Figura 1).
- Adicione o seguinte a um tubo de 1,5 ml e misture suavemente: L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promotor) (60 bng)1-2,5 μl L1-L2 pENTR4IRES2GFP (com gene de interesse) (80 bng)1-2,5 μl lentivector K7 (80 ng/μl)1 μl TE-tampão, pH 82-5 μl.Total 8 μl.
- Remova a mistura enzimática da clonase de -80 ° C e descongele no gelo por 2 min. Certifique-se de que esta enzima seja uma alíquota fresca de -80 ° C, pois a enzima reduziu substancialmente a eficiência de clonagem com ciclos repetidos de congelamento e descongelamento
- Adicione 2 μl de enzima por reação e misture bem via vórtice e incube a mistura de reação da clonase a 23-25 ° C por 6-24 horas.
- Adicionar 1 μl de solução de proteinase K (fornecida com o kit enzimático) à mistura de reacção da clonase e incubar durante 10 min a 37 °C.
- Transformar a mistura de reacção da clonase em células competentes e cultivar as colónias seleccionadas em meio LB contendo ampicilina (100 μg/ml) a 37 °C durante 16-18 horas.
- Extraia e purifique o DNA usando um kit Miniprep de DNA de plasmídeo comercial de acordo com as instruções do fabricante.
- Confirme o DNA via digestão usando as enzimas de restrição Spe I e Sac II e um tampão apropriado de acordo com as instruções do fabricante para remover o fragmento contendo o promotor e o gene de interesse.
NOTA: Esta etapa é crítica para verificar se o DNA subclonado possui o gene de inserção correto de interesse com a estrutura do vetor correto. O tamanho do vetor em si sem o fragmento inserido é de 6,7 kb. O tamanho do fragmento inserido liberado inclui tanto o promotor quanto o gene de inserção de interesse. Calcule os tamanhos de fragmentos esperados do resumo para o gene específico por meio de um programa de edição de sequência de DNA, por exemplo, APE-A Plasmid Editor.
- Verifique os tamanhos da estrutura do vetor de DNA e do fragmento liberado executando um gel de agarose a 1% em 1x tampão TAE (consulte a Tabela 1) a 100 V.
- Amplificar o ADN confirmado através da cultura de bactérias em 500 ml de meio LB contendo ampicilina (100 μg/ml) a 37 °C durante 16-18 horas.
- Extraia e purifique o DNA usando um kit comercial de DNA de plasmídeo Maxiprep de acordo com as instruções do fabricante.
nota: Maxiprep normalmente gera uma quantidade suficiente de DNA necessária para a produção viral.
- Repita as etapas 1.3.9-1.3.10 para amplificar os seguintes DNAs para preparações lentivirais: Vetor de envelope (PMD2. G, 6,1 kb), vetor de pacote (pBR8,91, 12,5 kb) e um vetor lentiviral vazio como controle (GFP-CMV-2K7, 8,7 kb).
2. Produção de vírus 2K7
NOTA: Dia 1:
- No dia da transfecção, coloque 32 milhões de células T HEK293 em um frasco T175 contendo 25 ml de meio de células T 293 do rim embrionário humano (HEK) (ver Tabela 1). Alternativamente, coloque 16 milhões de células no dia anterior à transfecção se o tempo se esgotar no dia da transfecção.
nota: A transfecção pode ser igualmente bem-sucedida ao plaquear as células no dia da transfecção ou antes do dia. Usando qualquer uma das duas alternativas, o ponto crítico aqui é garantir que as células estejam presas na superfície da placa de cultura antes da transfecção.
nota: Dia 2:
- Transfecção
- Antes da transfecção, dilua o DNA a 1 μg / μl em tampão de ácido tris-etilenodiaminotetracético (TE) que contém 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8 em água deionizada.
- Num tubo de 50 ml, preparar uma mistura principal (quadro 2) para a transfecção no balão T175. Adicione DNA ao meio de águia modificado de Dulbecco pré-aquecido (DMEM) e misture bem por vórtice, em seguida, adicione polietilenoimina estéril (PEI) (consulte a Tabela 1 para evitar precipitação prematura.
- Misture bem invertendo o tubo 3-4x e incube por 15 min em temperatura ambiente (RT).
- Execute uma alteração completa de mídia em HEK293T células. Aspirar completamente os meios de cultura das células e alimentá-los com meios de cultura de células HEK293T pré-aquecidos (25 ml por balão T175).
- Adicione a mistura de transfecção (mistura de DNA / PEI) gota a gota às células de monocamada. Mova suavemente para misturar bem e incubar as células transfectadas a 37 °C, 5% de CO2, durante a noite.
NOTA: Dia 3:
- Para garantir que a transfecção seja bem-sucedida, verifique a expressão da proteína de fluorescência verde (GFP) 24 horas após a transfecção por meio de microscopia fluorescente.
nota: Mais de 50% das células que expressam GFP normalmente indicam uma boa transfecção.
nota: Dia 4:
- Às 48 horas após a transfecção, recolher o sobrenadante viral e substituí-lo por meio HEK293 T novo (25 ml por balão T175).
- Centrifugue o sobrenadante viral a 1.140 x g por 10 min a 4 ° C para limpar os detritos celulares do sobrenadante. Transferir o sobrenadante limpo para um tubo de 50 ml e conservá-lo a 4 °C.
NOTA: Dia 5:
- Às 72 horas após a transfecção, colete o segundo lote de sobrenadante viral. Repita a etapa 2.3.1 e agrupe os sobrenadantes limpos por 48 e 72 horas.
- Para concentrar o vírus, centrifugue o sobrenadante viral a 170.000 x g por 90 min a 4 ° C usando tubos de ultracentrífuga de 30 ml.
- Rejeitar o sobrenadante e repetir o passo 2.6 até que todo o sobrenadante limpo tenha sido centrifugado, deixando um sedimento (invisível) de vírus e PEI precipitado no fundo do tubo.
- Para ressuspender o vírus, adicione 500 μl de meio SATO (ver Tabela 1) aos tubos de ultracentrífuga. Vortex por 30 segundos e raspe a base do tubo com uma ponta de pipeta para soltar mecanicamente o vírus. Repita esta etapa 6x para perder o pellet viral.
- Agrupe o vírus ressuspenso em tubos de microcentrífuga e gire muito brevemente para remover o PEI insolúvel. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,45 μm para remover as proteínas.
- Alíquota do vírus em alíquotas de 20 μl, 50 μl e 100 μl e armazená-lo a -80 °C.
3. Transdução de OPCs
- Cultura primária de OPCs em meio SATO (placa de 10ml/10cm) com fator neurotrófico ciliar (CNTF, 10 ng/ml), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF, 10 ng/ml), neurotrofina 3 (NT3, 1 ng/ml) e forscolina (4,2 μg/ml) a 37 °C, 8% CO2 por 24 horas após a dissecção.
- Aspire completamente o meio de cultura OPC e alimente as células com meio SATO recém-fabricado (10 ml) com fatores de crescimento (veja acima na etapa 3.1).
- Adicione o vírus aos OPCs até a concentração ideal, cultive OPCs por mais 48 horas.
4. Semeadura de OPC para coculturas mielinizantes (Figura 2)
- Para remover os OPCs da superfície, primeiro enxágue as placas OPC com 8 ml de solução salina balanceada de Earle (EBSS) duas vezes e, em seguida, incube as células com 5 ml de tripsina-EDTA a 0,05% quente diluído 1:10 com EBSS a 37 ° C por 2 min.
- Neutralize a tripsina com 30% de FBS em EBSS (5 ml) e remova as células da placa por pipetagem. Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml e centrifugar a 180 x g durante 15 min à RT.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 ml de meio SATO pré-aquecido, seguido de contagem de células.
- Antes da semeadura do OPC, aspire completamente o meio da placa de cultura DRG. Semeie suavemente 200.000 OPCs gota a gota nos neurônios DRG, conforme descrito anteriormente.
nota: O volume total de semeadura do OPC deve ser inferior a 200 μl por lamínula de 22 mm.
- Deixe as células assentarem sem mover a placa por 10 min na capa de cultura de tecidos e, em seguida, complete suavemente com 1 ml de meio SATO pré-aquecido por poço.
- Coloque novamente os OPCs irmãos restantes com meio SATO com fatores de crescimento (consulte a etapa 6.1). Use esses OPCs irmãos para verificar a expressão da proteína de interesse.
- Após 24 horas, substitua o meio SATO pelo meio de cocultura (2 ml/poço) contendo meio SATO (sem fatores) e neurobasal (v/v) por 1% de B2Mantenha as coculturas por 14 dias com troca de meio a cada 2-3 dias.
- Avalie as co-culturas para a expressão da proteína mielina por análise de western blot e visualize a formação de segmentos axonais mielinizados por imunomarcação dupla com anticorpos contra marcadores de proteínas básicas de mielina e marcadores neuronais.
