$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Classificação manual de neurônios de camundongo marcados com fluorescência
- Puxe os microcapilares de vidro (consulte a Tabela de Materiais) para um diâmetro de saída de 10–15 μm usando um extrator capilar com as seguintes configurações: calor: 508, tração: branco, vel: branco, tempo: branco.
- Conecte um tubo de silicone flexível de 120–150 cm (~0.8 mm de diâmetro interno) a um filtro de seringa de membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0.2 μm e uma válvula de tubo bidirecional usando conectores de tubo adequados.
- Prepare 500 mL de líquido cefalorraquidiano artificial resfriado (4 ° C) (ACSF, Tabela 1) e oxigene borbulhando oxigênio balanceado com 5% de dióxido de carbono através de uma pedra de ar por 15 min ou até que a solução desapareça completamente.
- Prepare 100 mL de ACSF com um coquetel de bloqueadores de atividade em um béquer de 150 mL (Tabela 1).
- Prepare 100 mL de ACSF com 1 mg / mL de protease IV da fração IV de Streptococcus em um béquer de 150 mL (Tabela 1).
- Prepare 100 mL de ACSF com solução de soro fetal bovino (FBS) a 1% em um béquer de 150 mL e oxigene com oxigênio balanceado com dióxido de carbono a 5% através de uma pedra de ar.
- Disseque o cérebro de um camundongo sacrificado abrindo o crânio com uma pequena tesoura e extraindo o cérebro fresco usando uma pinça fina sem danificar o córtex.
nota: Camundongos de qualquer linhagem, idade e sexo podem ser usados conforme desejado. Não congele o cérebro ou execute a classificação manual em camundongos injetados com vírus ou outros agentes perigosos / infecciosos.
- Mantenha o cérebro em ACSF resfriado e oxigenado, deixando uma pedra de ar ligada a 5% de oxigênio de equilíbrio de dióxido de carbono durante toda a duração do seccionamento.
- Posicione o cérebro no mandril vibratório e corte cortes coronais ou sagitais com 300 μm de espessura. Colete quantas seções forem necessárias para obter um mínimo de ~ 10 a 50 células marcadas até várias centenas de células. Coloque as fatias em um porta-fatias de malha de algodão, colocado dentro de um copo para que sejam banhadas em ACSF oxigenado.
- Mova as fatias frescas para um copo contendo ACSF com bloqueadores de atividade e bloqueie por 15 a 20 minutos em temperatura ambiente. Continue borbulhando oxigênio usando airstone.
- Mover as fatias para um copo contendo ACSF com a solução de protease para realizar uma digestão suave à temperatura ambiente: 20-30 min para os animais P4-14 ou até 45-60 min para os animais P28-56. Continue borbulhando oxigênio.
- Lave o ACSF com protease movendo as fatias de volta para o copo contendo a solução de ACSF com bloqueadores de atividade por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente. Continue borbulhando oxigênio.
- Mova as seções individuais para uma placa de Petri de 100 mm contendo ACSF com 1% de FBS à temperatura ambiente. Sob um escopo de dissecção fluorescente, microdissecar áreas e camadas de interesse com um mínimo de 10 a 50 células (até algumas centenas). Realize a microdissecção com um par de pinças finas ou anexando agulhas de injeção de 22 a 28 G em suportes de madeira (espetos).
- Usando uma pipeta Pasteur, mova as peças microdissecadas para um tubo de microfuga de 2 mL contendo ~ 0,8 mL de FBS a 1% em solução de ACSF.
- Triturar o tecido dissecado no tubo de microcentrífuga à temperatura ambiente. Faça três pipetas Pasteur de haste longa com diâmetros de saída decrescentes, rolando-as sobre uma chama aberta. Execute ~ 10 golpes com cada pipeta, começando com a maior e terminando com a menor.
- Dispense as células dissociadas em uma placa de Petri de 100 mm contendo ACSF oxigenado (a placa de Petri pode ser revestida com 5 mm de ágar a 1% ou composto de silicone transparente na proporção de 1:10, se desejado). Mantenha em temperatura ambiente.
- Aguarde ~ 5-7 min para que as células se estabilizem gradualmente e, em seguida, observe o sinal GFP / RFP sob um microscópio de dissecação.
nota: Células únicas, detritos e pequenos aglomerados serão visíveis em campo claro (BF).
- Escolha de 10 a 15 células GFP / RFP de cada vez usando uma pipeta capilar (da etapa 1.1) conectada a um tubo de silicone flexível (0,4 a 0,8 mm de diâmetro interno) e dispense as células em uma placa de Petri de 100 mm contendo ACSF oxigenado fresco.
- Bloqueando a extremidade da válvula da tubulação com a lingueta, posicione o capilar próximo à célula de interesse. Capture as células usando ação capilar ao aliviar o bloqueio e bloqueie rapidamente novamente para evitar que o excesso de fluido entre na pipeta. Dispensar as células para uma placa de Petri de 100 mm com ACSF oxigenado fresco, soprando suavemente, observando a ponta capilar sob óptica de fluorescência do microscópio de dissecação. Procure coletar ~ 100-150 células no total.
- Repita a etapa 1.19 mais uma ou duas vezes (dependendo dos detritos) e transfira um total de ~ 50-75 células para uma nova placa de Petri de 100 mm, certificando-se de que contaminantes como detritos sejam mínimos na óptica de contraste de interferência diferencial de campo claro (DIC).
Tabela 1: Lista de soluções e buffers.
| buffer | item | concentração | Quantidade (μL) |
| Buffer de coleta de amostra | Inibidor da ribonuclease recombinante | | 55 |
| Rcc | 1:50K diluído | 110 |
| Água livre de nuclease | | 605 |
| Alíquota 43,75 μL acima em 16 tubos (2 tiras de 8; 200 μL de tubos de PCR); adicione o seguinte por tubo |
| Iniciadores UMI (por exemplo, N10B1-N10B16) | 1 ng/μL | 6,25 μL/tubo |
| Volume final em cada tubo 50 μL (cada tubo pode ser dividido em alíquotas de 25 μL e congelado a -80 °C) |
| Soluções: | item | concentração | quantidade |
| LCR: para dissolver 5 L | NaCl | 126 mM | 36,8 gramas |
| Kcl | 3 mM | 1,15 gramas |
| NaH2PO4 | 1,25 mM | 0,75 g |
| NaHCO3 | 20 mM | 8,4 gramas |
| Para 500 mL de ACSF, borbulhe oxigênio por 10-15 min e adicione o seguinte fresco a cada vez: |
| D-glicose | 20 mM | 1,8 gramas |
| MgSO4 | 2 mM | 0,5 mL de estoque de 4 M |
| CaCl2 | 2 mM | 0,5 mL de estoque de 4 M |
| Mantenha o ACSF oxigenado por toda parte |
| Soluções: | item | Concentração |
| Coquetel bloqueador de atividade: faça um estoque de 100x |
| Para 100 mL de ACSF, adicione | | |
| APV | 0,05 mM | |
| CNQX | 0,02 mM | |
| TTX | 0,0001 mM (0,1 μM) |
| Soluções: | item | quantidade | |
| Solção de protease (100 mL) | Protease de Streptomyces griseus | 100 mg | |
| Soro fetal bovino: fonte comercial, alíquota em 500 μL para cada uso. |