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1. Colheita e cultura de células da linhagem OL (OL)
NOTA: Essas etapas devem ser executadas em uma capela de fluxo laminar em condições estéreis.
- No dia seguinte à agitação, prepare o meio Bottenstein-Sato (BS) de acordo com a Tabela 1.
- Enxágue as placas de Petri revestidas 3 vezes com água destilada estéril.
- Colher o sobrenadante dos frascos contendo principalmente células da linhagem OL, mas também algumas células microgliais e colocá-lo em placas de Petri de 100 mm não revestidas.
nota: Esta etapa permite a remoção das células microgliais por meio de adesão diferencial rápida na superfície da placa.
- Incubar as placas de Petri durante 15 min numa incubadora humidificada a 37 °C a 5% de CO2.
- Encher cada balão T150 com 25 ml de meio de cultura quente e acabado de preparar e incubar numa incubadora humidificada a 37 °C a 5% de CO2 até à segunda agitação.
- Transferir o sobrenadante das placas de Petri para novas placas de Petri de 100 mm não revestidas, a fim de permitir a adesão das células microgliais residuais.
- Incubar as placas de Petri durante 15 min numa incubadora humidificada a 37 °C a 5% de CO2.
- Remova o sobrenadante, que contém células da linhagem OL não aderentes, e transfira-o para tubos de 50 mL (sobrenadante de 2 placas de Petri para um tubo de 50 mL). Descarte as placas de Petri banhadas com microglia.
- Centrifugar o sobrenadante durante 5 min a 423 x g. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com 1 mL de meio BS. Agrupe todos os pellets em um tubo comum de 50 mL e ajuste o volume para 10 mL com meio BS.
- Determine a densidade celular contando as células sob um microscópio.
nota: Deve ser obtida uma densidade celular entre 3 x 105 células/mL e 5 x 105 células/mL.
- Adicione 20 mL de BS se a densidade celular for maior ou igual a 4 x 105 células/mL para obter um volume final de 30 mL, ou adicione apenas 10 mL de BS se a densidade celular for menor que 4 x 105 células/mL para obter um volume final de 20 mL.
- Placa de duas ou três placas de Petri pré-revestidas de 100 mm com 10 mL de suspensão celular. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C sob 5% de CO2.
- Limpe os detritos das placas de Petri atualizando todo o meio BS 2 h depois.
nota: Examine a cultura ao microscópio antes e depois da limpeza para verificar a densidade celular e a eficiência da remoção de detritos.
- Incubar por 2 dias em meio BS em uma incubadora umidificada a 37 °C sob 5% de CO2.
nota: Examine a cultura ao microscópio. A confluência deve ser de 70% a 80%.
2. Produção de OCM
NOTA: Execute estas etapas em uma capela de fluxo laminar em condições estéreis.
- Preparar o meio baixo NB-B27 de acordo com a Tabela 2.
- Renove o meio de cultura com 10 ml de meio quente NB-B27low. Incubar durante 2 dias numa incubadora humidificada a 37 °C a 5% de CO2.
- Colha o OCM, ou seja, o sobrenadante contendo fatores secretados por OL. Filtre-esterilize o OCM usando um filtro de 0,22 μm.
nota: Conservar OCM a 4 °C durante um máximo de 2 meses.
Tabela 1: Preparação de meios de Bottenstein-Sato (BS).
| Mídia de Bottenstein-Sato (BS) | Concentração final |
| Meio Eagle Modificado de Dulbecco | |
| Penicilina-estreptomicina | 100 UI/ml |
| apo-Transferrin humano | 100 μg/mL |
| BSA (Albumina de Soro Bovino) | 100 μg/mL |
| insulina | 5 μg/ml |
| PDGF | 10 ng/mL |
| progesterona | 62 ng/mL |
| Cloridrato de putrescina | 16 μg/mL |
| Selenito de sódio | 40 ng/mL |
| T3 (sal de sódio de 3,3',5-triiodo-L-tironina) | 30 ng/mL |
| T4 (L-tiroxina) | 40 ng/mL |
Tabela 2: Preparação dos meios NB-B27low e NB-B27.
| NB-B27 mídia baixa | Concentração final |
| Neurobasal | |
| Suplemento B27 | 0,5x |
| L-glutamina | 0,5 mM |
| Penicilina-estreptomicina | 100 UI/ml |
| Mídia NB-B27 | Concentração final |
| Neurobasal | |
| Suplemento B27 | 1x |
| L-glutamina | 0,5 mM |
| Penicilina-estreptomicina | 100 UI/ml |