- Cultura compartimentada de gânglios da raiz dorsal de ratos (DRGs), oligodendrócitos (OPCs) e hGCs (células de glioma humano)
1. Preparação de pratos de cultura compartimentados
NOTA: Execute as etapas a seguir nos dias anteriores à colheita planejada dos DRGs.
- Monte pratos de cultura compartimentados.
- Diluir a solução-mãe de colagénio a 500 μg/ml em H 2 O destilado estéril; misturar bem.
- Com uma pipeta de transferência estéril, encher uma placa de cultura de 35 mm com 2 ml de solução de colagénio; remover a solução, deixando uma fina película de colagénio, e colocá-la na placa de 35 mm seguinte. Repita esse processo, adicionando mais solução de colágeno conforme necessário, até que todos os pratos tenham sido revestidos.
- Depois que todas as placas estiverem revestidas, coloque-as em uma bandeja de cultura de 245 mm x 245 mm e coloque três compressas de gaze de 1 mm x 1 mm no centro da bandeja.
- Para polimerizar o colágeno, molhe compressas de gaze com 1 mL de hidróxido de amônio concentrado e cubra as bandejas por 15 min.
- Retire as compressas de gaze e deixe secar a loiça de 35 mm na campânula de fluxo laminar.
- Enquanto a louça está secando, carregue o cilindro do aplicador de graxa da seringa com graxa de alto vácuo. Coloque as câmaras compartimentadas em uma garrafa de mídia de boca grande cheia de água destilada. Esterilize ambos em autoclavagem e deixe esfriar.
- Lixe a ponta de um agulhado 18-G para fazer uma ponta romba. Esterilize em etanol 70%. Encaixe a agulha na seringa de gordura.
- Esterilize o ancinho embebendo-o em etanol a 70%; deixe-o secar ao ar na capela de fluxo laminar.
- Retire a tampa de um prato seco de 35 mm revestido de colagénio. Segure o prato entre o polegar e o indicador. Segure o ancinho com a outra mão. Aplique uma pressão firme para criar arranhões de até 200 μM de largura no centro do prato.
- Usando uma pipeta de pastagem, coloque duas gotas de Meio Basal Neuronal Suplementado no centro dos arranhões.
- Repita as etapas 1.1.10-1.1.11 até que todos os pratos tenham sido arranhados.
- Seque as câmaras compartimentadas em uma capela de fluxo laminar.
- Com pinça hemostática estéril, segure uma câmara compartimentada pelo divisor central. Vire a pinça hemostática para que o fundo da câmara fique voltado para cima.
- Aplique graxa de silicone na câmara compartimentada, começando pela parte superior. Certifique-se de que a graxa seja colocada ordenadamente e se sobreponha em todos os cantos.
- Retire a tampa de um prato de 35 mm. Inverta o prato e coloque os arranhões sobre a câmara. Bata suavemente na parte inferior da placa com uma pinça.
- Vire suavemente a placa usando a pinça hemostática. Solte a pinça.
- Coloque um monte de graxa na base do compartimento central. Encha cada câmara com Meio Basal Neuronal Suplementado (NB) e verifique se há vazamentos. Vede vazamentos com graxa de silicone conforme necessário.
- Continue montando todos os pratos de cultura e armazene durante a noite a 37 ° C, 5% CO2.
