Isolando dobras neurais cranianas de um embrião de pintinho para uma cultura de células da crista neural

Resumo

Fonte: Jacques-Fricke, B. T., et al. Preparação e Análise Morfológica de Culturas de Células da Crista Neural Craniana de Pintinhos. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo ilustra uma técnica para isolar as dobras neurais cranianas da região do mesencéfalo de embriões de pintinhos. Apresenta um processo detalhado de dissecção das dobras neurais, sua colocação e fixação em lamínulas revestidas com fibronectina, seguido pela observação da migração das células da crista neural das dobras neurais.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de soluções e materiais

1. Prepare a solução de Ringer misturando 123,3 mM de NaCl, 1,53 mM de CaCl₂, 4,96 mM de KCl, 0,809 mM de Na₂HPO₄ e 0,147 mM de KH₂PO₄ (ver Tabela de Materiais). Ajuste o pH para 7,4 e filtre a esterilização em frascos de 100 mL. Armazene em local limpo e seco. Não lave garrafas com sabão (trate como vidraria de cultura de tecidos).
2. Prepare 1 mg / mL de solução estoque de fibronectina (FN) (consulte a Tabela de Materiais) dissolvendo FN em solução estéril de Ringer e armazene em alíquotas de 100 μL a -80 ° C (estável por pelo menos 4 anos).
3. Prepare meios de cultura completos suplementando o meio L15 com 0,8% de L-glutamina, 0,08% de penicilina/estreptomicina, 10% de FBS e 10% de extrato de embrião de pintinho. Crie alíquotas de 3 mL e armazene a -20 °C ou -80 °C.
   nota: Se as culturas forem incubadas em uma incubadora de CO₂, o meio de águia modificado F12 de Dulbecco (DMEM/F12) precisa ser substituído por L15, que é tamponado para ar.
4. Prepare molduras de suporte de papel de filtro (retângulos de papel de aproximadamente 1 cm x 1,5 cm com dois ou três orifícios perfurados sobrepostos no eixo longo).
   1. Faça furos ao longo da borda de um pedaço grande de papel de filtro usando um furador padrão de três furos, corte/apare a borda perfurada em uma tira e, em seguida, corte a tira entre os furos em retângulos ~ 1.5 cm de comprimento. Papéis de filtro em autoclave antes de usar (opcional).
5. Reúna ferramentas de dissecação, incluindo pinças finas (# 5), pinças rombas, tesouras de dissecação, tesouras de mola e agulhas afiadas de tungstênio.

2. Preparação de pratos de cultura

1. Selecione placas de cultura de dobras neurais (consulte a Tabela de Materiais) apropriadas para a aplicação a jusante.
   1. Para culturas que serão fixadas e coradas, use lamínulas de vidro colocadas em placas de cultura de tecidos com vários poços.
      nota: As lamínulas que correspondem ao tamanho do poço se moverão menos com a mistura de fluidos, tornando os explantes menos propensos a se deslocar e mais propensos a aderir à lamínula em vez do fundo do prato.
   2. Selecione pratos de câmara única com fundo de vidro ou câmara dividida (consulte Tabela de Materiais) para imagens ao vivo com um microscópio invertido.
   3. Para imagens ao vivo em um microscópio vertical ou estereoscópico, use placas de cultura de tecidos opticamente apropriadas de 6, 12 ou 24 poços.
   4. Selecione placas de cultura de tecidos plásticos para a coleta em massa de células migratórias da crista neural para análises de alto rendimento.
2. Adicione 10 U/mL de penicilina e 10 μg/mL de estreptomicina a um frasco de 100 mL de solução de Ringer estéril (por exemplo, 100 μL de penicilina 10.000 U/mL e 10.000 μg/mL de estreptomicina, para fazer P/S de Ringer). Use o Ringer's P/S dentro de 1 semana.
3. Descongele uma alíquota de 1 mg/mL de FN no gelo. Diluir com Ringer's P/S até uma concentração de 10-100 μg/ml de FN.
4. Pipetar solução de FN suficiente para cobrir o fundo do poço ou prato. Por exemplo, 100 μL por poço em uma placa de 24 poços, 500 μL para uma placa de 35 mm.
5. Recoloque a tampa e incube pratos ou pratos com solução de FN em uma incubadora umidificada (ou uma bandeja coberta com toalhas de papel destiladas embebidas em água) a 38 ° C (100 ° F) por pelo menos 1 h enquanto disseca as dobras neurais.

3. Dissecando dobras neurais

1. Transfira um embrião para um prato limpo contendo a solução de Ringer P/S e enxágue o embrião segurando a moldura de papel de filtro com uma pinça e balançando suavemente para frente e para trás para limpar qualquer gema que obscureça a visão do embrião. Troque o P / S da campainha ou transfira para um prato fresco se ficar turvo.
2. Posicione o embrião dorsal/quadro voltado para cima sob um microscópio de dissecação. Deixando o embrião na moldura de papel para mantê-lo esticado e mantido no lugar, remova a membrana vitelina usando uma pinça para expor as dobras neurais.
   nota: Se o embrião cair da moldura do papel, ele pode ser colocado no prato ou preso a um prato revestido de sylgard para dissecação.
3. Usando uma tesoura de mola ou uma agulha afiada de tungstênio, excise cuidadosamente as dobras neurais do mesencéfalo. Inclua tecido caudal às vesículas ópticas em expansão e rostral ao rombencéfalo, onde as constrições rombomeras estão apenas começando a aparecer (o crescente cardíaco também é um indicador útil, Figura 1B, C). Tome cuidado para extirpar o aspecto mais dorsal da prega neural com o mínimo de tubo neural contaminante e ectoderma não neural (Figura 1C).
4. Transfira as dobras neurais para um prato limpo contendo o P/S de Ringer usando um pipetador P20 ou uma pipeta Pasteur de vidro estéril enxaguada com P/S de Ringer gema (isso bloqueia o plástico ou vidro para evitar que o tecido grude). Armazene as dobras coletadas no gelo enquanto disseca as dobras adicionais.

4. Revestimento de dobras neurais

1. Descongele uma alíquota de meios de cultura completos (seção 1, etapa 3). Adicione 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina e filtre a esterilização. Mantenha a mídia preparada a 37-38 °C enquanto executa outras etapas.
2. Remova as placas de cultura da incubadora (seção 2, etapa 5). Usando um pipetador ou pipeta Pasteur, remova a solução de FN de lamínulas, pratos ou poços. Depois de enxaguar o substrato revestido com FN com Ringer's P/S, adicione um volume apropriado de meio de cultura completo aos pratos ou alvéolos (500 μL para alvéolos em uma placa de 24 poços, 2 mL para um prato de 35 mm ou uma placa de seis poços).
   nota: Volumes menores podem preservar reagentes caros (por exemplo, tão baixos quanto 200 μL para uma placa de 24 poços), mas garantem que o prato seja suficientemente umidificado para evitar a evaporação.
3. Usando um pipetador p20 ou p200, primeiro, enxágue a ponta da pipeta com gema de Ringer P/S para bloquear o plástico e evitar que o tecido grude. Em seguida, transfira as dobras neurais isoladas para as lamínulas revestidas com FN, tomando cuidado para transferir o mínimo possível de P / S de Ringer. Coloque a(s) dobra(s) em direção ao centro da lamínula revestida com FN.
   nota: Uma ou algumas dobras neurais podem ser plaqueadas em uma lamínula de 12 mm em um poço de 19 mm, até 50 em uma placa de 35 mm.
4. Depois de permitir que os explantes assentem por 10-15 min, coloque-os em uma câmara umidificada a 38 ° C (100 ° F), carregando lenta e cuidadosamente as placas de cultura com dobras neurais revestidas. Isso minimizará o deslocamento das dobras neurais nos poços, garantindo que eles permaneçam dispersos e adiram a quaisquer lamínulas.
   nota: Ao usar L15 (não DMEM), as placas de cultura de explante também podem ser incubadas em uma incubadora de ovos usando uma bandeja coberta com toalhas de papel umedecidas.
5. Incube culturas de dobras neurais na incubadora umidificada durante a migração ativa (cerca de 16-20 h no total, Figura 2).

Resultados

Figura 1. Dissecção das pregas neurais dorsais de pintinhos. Trabalhando no P / S de Ringer, tesouras de mola foram usadas para extirpar dobras neurais. (A) Vista dorsal do embrião, anterior em direção ao topo da figura. As dobras neurais parecem mais opacas do que o tecido circundante. As pregas neurais do mesencéfalo ficam posteriores aos lobos ópticos (rosa) e anteriores ao cresce...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AxioObserver equipado com um cabeçote de varredura confocal LSM710 controlado pelo software ZEN 3.0 SR	Zeiss		Objetiva alfa usada Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
Pratos de câmara (fundo de vidro, simples ou dividido)	MatTek; Célula Vis	P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis)	Câmara única 35 mm ou 4 câmaras 35 mm
Vidro de cobertura	Companhia de Suprimentos Biológicos Carolina	633029, 633031, 633033, 633035, 633037	círculos, 0,13–0,17 mm de espessura, disponíveis em 12-25 mm de diâmetro
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033	Alternativa para mídia L15
Incubadora de ovos	esportista	1502
FBS	Tecnologias da Vida	Rolamento 10437-028
Fibronectina	Fisher Científico	CB-40008A
Papel de filtro	O que homem		cromatografia de grau 3MM
Fórceps (romba)	Fisher Científico; Thomas Científico	08-890 (Pescador); 1141W97 (Thomas)
Fórceps (fino)	Ferramentas de Belas Ciências	11252-20	Dumont #5
Suporte de pino	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 26016-12	Para agulha de tungstênio (alternativa para tesoura de mola)
Kcl	Sigma-Aldrich	Pág. 3911
KH2PO4	Sigma-Aldrich	Pág. 0662
Mídia L15	Invitrogen	11415064
L-glutamina	Invitrogen	25030
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9638
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Penicilina/estreptomicina	Tecnologias da Vida	15140-148	10.000 unidades/mL de penicilina; 10.000 mg/mL de estreptomicina
Placas de Petri	VWR (ou similar)		60 mm, 100 mm
Tesoura (dissecação)	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 14061-10
Tesoura de mola	Ferramentas de Belas Ciências	15000-08	Aresta de corte de 2,5 mm (alternativa para agulha de tungstênio)
Silgard	Krayden	Sylgard 184
Filtros de seringa	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Unidade de filtro de seringa Millex-GV, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, esterilizada por gama
Placas de cultura de tecidos	Sarstedt	83-3900	Placas de cultura de 35 mm para culturas de pregas neurais em massa
Fio de tungstênio	Variedade de fontes		0,01 "de diâmetro para agulha de tungstênio (alternativa para tesouras de mola)