Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparativos
NOTA: As soluções e ferramentas descritas nesta seção podem ser feitas com bastante antecedência e usadas no dia da dissecação e gravação.
- Prepare o meio Liebovitz suplementado com HEPES 10 mM (solução L-15). As etapas a seguir descrevem a produção de 1 L de solução de L-15.
- Despeje 990 mL de H2O deionizado em um copo. Meça e adicione 2.386 g (10 mM) de HEPES. Adicionar um frasco de 1 L de solução L-15 em pó.
NOTA: O L-15 em pó tem uma vida útil mais longa e ocupa menos espaço de armazenamento. Como alternativa, compre a solução de L-15 e suplemente com HEPES. A última opção também tem a opção de usar uma solução sem fenol, que é útil para imagens de fluorescência.
- Mexa a solução em uma placa de agitação. Usando um medidor de pH, adicione lentamente 1 N de hidróxido de sódio (NaOH) para obter um pH entre 7,34 e 7,36.
- Adicionar H2O deionizado até que a solução atinja um volume de 1.000 ml. Filtrar a solução utilizando uma membrana de poros de 0,22 μm.
nota: A solução de L-15 pode ser conservada a 4 °C durante 1-2 semanas. Se estiver usando L-15 feito com vermelho de fenol, a solução ficará rosa se muito básica (pH > 7,4) ou laranja se muito ácida (pH < 7,34).
- Prepare o meio de cultura para os neurônios do gânglio vestibular (VGNs). Siga os passos abaixo para fazer 50 mL de meio de cultura:
- Adicione 47,5 mL de meio essencial mínimo GluMAX-I a um copo de vidro limpo.
- Meça e adicione 0,1194 g (10 mM) de HEPES. Este tampão adicional resiste às mudanças de pH enquanto as células se acomodam antes de serem movidas para a incubadora.
- Adicione 2,5 mL de soro fetal bovino (FBS). Isso perfaz 5% em volume de FBS em um volume total de 50 mL de meio.
- Mexa a solução em uma placa de agitação. Usando um medidor de pH, adicione lentamente 1 N NaOH para obter um pH entre 7,38 e 7,4.
- Adicione 0,5 mL de penicilina-estreptomicina. Filtrar a solução através de um filtro estéril de 0,22 μm. Conservar a solução a 4 °C.
- Pelo menos 30 minutos antes da utilização, transferir os meios de cultura para um balão de cultura de tecidos com uma tampa ventilada. Colocar o balão com meios de cultura numa incubadora com concentração de CO2 a 5% a 37 °C.
2. Fabricação de pipetas de trituração
NOTA: As pipetas de trituração podem ser reutilizadas para vários experimentos. Lave as pipetas com etanol, água e solução de L-15 antes de cada uso e limpe-as com água e etanol após cada uso. Armazene cuidadosamente entre os usos.
- Para preparar pipetas de trituração para dissociação celular, segure uma pipeta Pasteur de vidro na chama de um bico de Bunsen. Assim que a ponta do vidro começar a derreter, estique-o até o diâmetro desejado. Puxe uma extremidade da pipeta para longe da chama para criar uma pequena curva.
- Aproxime a pipeta dobrada de um microscópio. Usando uma peça de corte, marque e quebre o vidro no diâmetro desejado.
- Passe a ponta da pipeta por cima da chama do bico de Bunsen. Isso polirá rapidamente as bordas ásperas perto da ponta. Verifique se a ponta não está selada pela chama.
- Repita o processo até que quatro ou cinco pipetas tenham sido preparadas com tamanhos variados.
3. Extração do gânglio vestibular e plaqueamento dos neurônios vestibulares
- Preparação para dissecção
- Prepare uma mistura enzimática de solução L-15 com colagenase a 0,05% e tripsina a 0,25%. Por exemplo, adicione 0,001 g de colagenase e 0,005 g de tripsina a 2 mL de solução de L-15 em um béquer, adicione um pequeno agitador magnético e mexa até ficar totalmente misturado. Reserve em temperatura ambiente.
- Prepare uma guilhotina obtida comercialmente colocando toalhas de papel ao lado e embaixo da guilhotina para minimizar a exposição da bancada e outras superfícies ao sangue e outros materiais biológicos.
- Coloque grandes tesouras de aço inoxidável, pinças grandes e tesouras grandes de mola. Mantenha um borrifador grande com etanol 70% à mão para limpar a cabeça.
- Encha um copo de 100 ml com solução de L-15 e coloque-o sobre gelo. Oxigenar a solução de L-15.
- Disponha a tesoura de mola, a tesoura cirúrgica, a pinça, o bisturi e a pipeta de transferência (consulte a Tabela de Materiais).
- Preparar uma placa de Petri de 60 mm (para a dissecção macroscópica) e duas placas de Petri de 35 mm (para a limpeza/dissecção fina dos gânglios). Encha o prato de 60 mm com solução oxigenada de L-15 usando uma seringa de 30 mL com uma ponta de filtro de 0,22 μm.
- Eutanásia, limpeza da cabeça e hemissecção
- Pese os filhotes para calcular a dosagem apropriada de diluição fatal mais para administrar por via intraperitoneal (~ 0,01 mL por 10 g).
- Uma vez atingido um plano profundo de anestesia, conforme avaliado pela falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, decapite usando a guilhotina.
- Enxágue bem a cabeça com etanol a 70% e depois com solução de L-15.
- Remova completamente a pele do crânio. Dividir a cabeça usando uma tesoura de mola grande, começando no ponto de entrada da medula espinhal para o cérebro e fazendo dois cortes, o primeiro cortado na parte superior do crânio e o segundo na parte inferior da mandíbula. Termine de dividir a cabeça usando uma tesoura cirúrgica.
- Coloque as duas metades da cabeça voltadas para baixo em uma placa de Petri de 60 mm cheia de solução de L-15. Coloque o tecido fresco que não está sendo dissecado no gelo.
- Extração do gânglio vestibular superior
- Retire o cérebro usando uma tesoura cirúrgica fechada. Corte e remova o nervo craniano para separar completamente o cérebro do crânio.
nota: Neste ponto, a cápsula ótica (em forma de número 8) deve estar visível na parte de trás da cabeça.
- Usando uma pinça e começando na parte de trás da cabeça, puxe o material membranoso transparente.
- Corte a parte superior do crânio usando uma tesoura cirúrgica. Remova o excesso de tecido da parte de trás da cabeça e pescoço para tornar a área de dissecção e a cápsula ótica mais limpas e de fácil acesso.
nota: Evite deixar o prato muito turvo descartando o excesso de tecido durante o procedimento.
- Transferir o tecido para uma segunda placa de Petri com uma solução fresca de L-15. Localize a cápsula ótica e os nervos auditivo, vestibular superior e vestibular inferior. Corte o nervo auditivo e separe os gânglios superior e inferior usando uma pequena tesoura de mola.
nota: Embora os somata do nervo vestibular sejam encontrados nos gânglios inferior (mais finos) e superiores (mais grossos), as células extraídas do gânglio superior têm melhor sobrevida.
- Usando um bisturi, raspe suavemente a crista óssea para enfraquecer a área óssea sob a qual o nervo mergulha na cápsula óssea. Remova cuidadosamente os detritos com uma pinça fina, expondo toda a porção inchada do gânglio.
- Use a tesoura de mola fina para cortar e separar o gânglio do ramo nervoso periférico que está mergulhando em direção ao utrículo.
- Remova o gânglio superior usando uma pinça fina, certificando-se de não beliscar muito perto do tecido ganglionar. Transferir para uma placa de Petri de 35 mm com solução fresca de L-15.
- Antes de prosseguir, pré-aqueça a solução enzimática: despeje a mistura enzimática em uma placa de Petri de 35 mm e coloque em uma incubadora a 37 °C por 10-15 min.
- Limpe o gânglio usando uma pinça fina e uma pequena tesoura de mola, removendo o osso (que parece branco e cristalizado na estrutura), o excesso de tecido, as fibras nervosas e quaisquer outras estruturas supérfluas. Tome cuidado para minimizar a remoção de qualquer tecido ganglionar.
- Dissociação e plaqueamento de tecidos
- Transfira os gânglios limpos para a solução enzimática pré-aquecida e coloque-os de volta na incubadora por 10 a 40 min. O tratamento enzimático está completo quando o tecido começa a se separar, mas permanece inteiro. O tratamento excessivo do tecido com enzimas resultará na dissolução completa dos gânglios antes da trituração.
NOTA: A quantidade de tempo que o tecido passa por tratamento enzimático depende da idade do animal. Por exemplo, os gânglios de ratos P9 são tratados com enzima por 25 min, e os gânglios de ratos P15 são tratados com enzima por 35 min.
- Transferir os gânglios para a placa de Petri de 35 mm com uma solução fresca de L-15 e incubar durante 2-3 min.
- Transferir os gânglios para outra placa de Petri de 35 mm cheia de meios de cultura filtrados.
- Usando uma micropipeta de 200 μL, pipete uma gota de ~ 150 μL de meio de cultura filtrado em um prato com fundo de vidro revestido. Não adicione muita solução, pois é importante manter a tensão superficial para formar uma bolha de solução que permanece sobre a lamínula de vidro.
- Transfira o número desejado de gânglios (um a quatro) para a lamínula.
- Retire uma pequena quantidade de meio de cultura da placa de cultura para enxaguar a pipeta de trituração com meio para evitar que o tecido grude nas laterais da pipeta de vidro. Triturar passando suave e repetidamente o tecido pela pipeta até que os gânglios estejam suficientemente dissociados.
nota: Não sobrecarregue o tecido para tentar suspensões unicelulares ou permitir que as células caiam no fundo do prato usando pressão positiva excessiva. Além disso, evite formar bolhas de ar, pois isso reduzirá a sobrevivência celular. A trituração suave é a chave para alcançar a sobrevivência celular bem-sucedida.
- Deixe as células descansarem por 5 min. Verifique em um microscópio óptico para ver se as células se acomodaram na lamínula.
- Coloque cuidadosamente uma placa de cultura em uma incubadora a 37 °C por 12-24 h. Novamente, certifique-se de manter a bolha de solução intacta.
nota: Ao cultivar por mais de 24 horas, atualize os meios de cultura diariamente. Este pode ser um possível ponto de pausa.
