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Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Dissociação tecidual
NOTA: Todos os procedimentos a seguir são realizados em uma sala de cultura de tecidos estéreis designada como biossegurança usando técnica asséptica e materiais estéreis.
- Adicione 1 mL de tripsina a 0,05% contendo 0,53 mM de EDTA a cada tubo cônico de 15 mL de 9 mL de DMEM e tecido para iniciar a lise tecidual.
nota: O DMEM contém uma grande quantidade de cloreto de cálcio, que pode atuar como um inibidor da tripsina. Se a dissociação não estiver completa seguindo as etapas descritas, a solução salina balanceada de Hanks sem cálcio ou magnésio pode ser usada. Após a tripsinização, a enzima pode ser neutralizada pela adição de um inibidor de tripsina, embora o cálcio deva ser adicionado de volta à solução, pois é um cofator para a DNase I, que é usada nas etapas subsequentes.
- Triturar com pipeta de 10 mL aproximadamente 20x.
- Transfira as suspensões celulares para tubos cônicos vazios de 50 mL.
- Incubar a solução a 37 °C, CO2 a 5% durante 15 min, agitando suavemente os lisados após 8 min.
- Adicione 5 mL de MGM e 200 μL (5 mg / mL) DNase I a cada tubo para uma concentração final de 50 μg / mL.
- Triturar cada lisado com uma pipeta de 10 mL 10x.
- Deixe as suspensões celulares descansarem por 3 minutos em temperatura ambiente para permitir que o tecido não dissociado se deposite no fundo dos tubos.
- Transferir as suspensões celulares para novos tubos cônicos de 50 mL, deixando para trás o tecido não dissociado.
nota: As etapas de lise e trituração descritas acima limitam significativamente a quantidade de tecido não dissociado.
- Centrifugue os tubos a 300 x g durante 3 min a 4 °C sem travão.
- Aspire o sobrenadante e ressuspenda os grânulos celulares restantes em 5 mL de MGM.
- Triturar o pellet com uma pipeta de 5 mL 20x.
- Colocar as suspensões de células de 5 ml em balões T25 revestidos.
- Incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 e trocar o meio inicialmente após 24 h para remover os detritos celulares.
nota: Alguns protocolos recomendam uma troca inicial de mídia após 72 h. A otimização desta etapa pode ser necessária.
- Realize uma troca de 100% do meio com MGM a cada 48-72 h até que as células estejam 80% confluentes (aproximadamente 5-7 dias).
NOTA: Todos os meios devem ser aquecidos a 37 °C antes das mudanças de mídia.
2. Isolamento de células precursoras de oligodendrócitos
Ao revestir OPCs após o isolamento inicial, eles devem ser revestidos em uma superfície revestida de poli-D-lisina (placa estéril ou lamínula). Prepare esses materiais antes de concluir esta seção.
- Após 15 h de agitação, retirar o sobrenadante dos balões e da placa sobre uma placa de Petri esterilizada de 100 mm.
- Incube o sobrenadante a 37 °C, 5% de CO2 por 30 min, girando após 15 min para remover a micróglia restante, pois elas aderirão muito rapidamente ao prato. Placas de Petri não tratadas com cultura de tecidos podem ser usadas para esta etapa.
- Remova o sobrenadante de células não aderentes, conte e coloque em uma superfície revestida de poli-D-lisina. Normalmente, 7.500-10.000 OPCs são plaqueados/cm2.
- Incube a 37 °C, 5% de CO2 por pelo menos 1 h (até 6 h), depois aspire suavemente 95% do meio e adicione lentamente o meio OPC quente, pipetando o meio contra a parede do poço para minimizar a interrupção dos OPCs. Troque a mídia a cada 48 h até que as células estejam prontas para uso.
NOTA: É fundamental que apenas um poço seja trocado por vez. Os OPCs são sensíveis e são especialmente intolerantes a condições secas. A adição de PDGF-AA em meio OPC é para retardar a maturação do OPC em oligodendrócitos. Este fator pode ser excluído dos meios de cultura se o foco experimental for oligodendrócitos maduros.
Tabela 1: Receitas de buffer e mídia.
Mídia Glia Mista (MGM)
| 88 mL | 1X DMEM (glicose alta, com L-glutamina, com piruvato de Na) |
| 10 mL | FBS inativado por calor |
| 1,0 mL | L-Glutamina (100X) |
| 1,0 mL | Antibiótico/Antimicótico |
Mídia OPC (50mL)
| 49 mL | Meios neurobasais |
| 1,0 mL | Suplemento B27 (50X) |
| 10 ng/ml | PDGF-AA |
| NOTA: PDGF-AA é adicionado fresco antes de cada mudança de mídia. |