1. Manutenção de células-tronco
- Mantenha as hESCs H9 em uma camada de matriz de membrana basal reduzida pelo fator de crescimento (consulte a Tabela de Materiais, doravante simplesmente chamada de matriz) de acordo com as instruções do fabricante.
- Para revestir uma placa de 6 poços ou uma placa de 10 cm, combine 100 μL de matriz com 5,9 mL de meio Eagle modificado (DMEM) / F12 de Dulbecco gelado. Embrulhe as placas em filme de parafina e armazene durante a noite a 4 °C. Use-as no dia seguinte para células em passagem após a aspiração do excesso de matriz/meio.
- Cultive as células semana a semana em uma proporção de divisão de aproximadamente 1:12 a cada 7 dias. Mantenha as células usando meio mTESR-1 em uma incubadora de baixo oxigênio a 37 ° C (5% O2, 5% CO2). Atualize a mídia diariamente. Elimine as células diferenciadoras da cultura entre as passagens usando ferramentas de vidro.
- As células H9 devem ser eliminadas quatro a seis dias antes de serem utilizadas para produzir organoides. As células devem ser passadas em uma proporção de aproximadamente 1:8 de aglomerados de células. Para fazer isso, comece enxaguando as células com o meio modificado Eagle / mistura de nutrientes F-12 (DMEM / F12) de Dulbecco e dissocie as células com uma protease neutra (por exemplo, dispase, doravante referida simplesmente como protease), enxágue com DMEM / F-12 e coloque como 30-60 aglomerados de células em 4 placas (6 poços ou 10 cm) a ~ 20% de confluência. Dois dias antes da colheita, faça a transição para uma incubadora regular (21% O2, 5% CO2). As placas devem atingir ~ 80% de confluência ao iniciar a formação do organoide.
2. Dissociação das hESCs para cultura organoide
- Alíquota da solução-mãe de protease (5 U/mL).
nota: Normalmente, congelamos alíquotas de 1 mL a -20 ° C para uso por vários meses.
- Diluir a solução-mãe de protease até à concentração de trabalho, adicionando 1 ml da solução-mãe mais 5 ml de DMEM/F12 por cada placa de 6 poços ou 10 cm de hESCs.
- Aspirar e remover os meios de cultura de células e, em seguida, cobrir as hESCs com a solução de protease. Coloque as placas na incubadora por 10-15 min ou até que as bordas das colônias se arredondem e comecem a se separar da matriz.
- Incline a placa, aspire a solução de protease e lave suavemente as células com DMEM/F12 três vezes. Use 2 mL/poço para cada lavagem ao usar uma placa de 6 poços e 6 mL ao usar uma placa de 10 cm. Certifique-se de que as colônias permaneçam presas à matriz ao executar esta etapa.
- Adicione de volta cerca de 1,5 mL de meio mTESR fresco a cada poço (ou 5 mL para uma placa de 10 cm) e lave as células da placa usando pipetagem suave.
- Usando uma pipeta de 10 mL, aspire suavemente e dispense hESC dentro da placa até que atinjam aproximadamente 1/30 de seu tamanho original. Os aglomerados de colônias devem se assemelhar a quadrados de ~ 250-350 μm na conclusão dessas etapas.
3. Geração de Organoides
- Transfira as células para um único frasco T75 de fixação ultrabaixa contendo 30 mL de meio mTESR sem fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF).
- No dia seguinte, incline o(s) frasco(s) de forma que as células vivas se acumulem no canto (isso pode levar de 5 a 10 minutos no primeiro dia, mas ficará mais rápido à medida que os aglomerados ficarem maiores).
nota: Se houver um grande número de células aderidas ao fundo do balão nesta etapa ou em qualquer etapa subsequente, transfira as células para um novo frasco. É normal ter uma alta população de células mortas nos primeiros dois dias. Ao realizar alterações de mídia, certifique-se de remover o máximo possível de detritos celulares.
- Assim que as células se assentarem, aspire o meio e as células mortas, deixando cerca de 10 mL de meio contendo as células vivas.
- Adicione ~ 20 mL de meio de baixo bFGF (DMEM / F12 suplementado com 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamina, 1x aminoácido não essencial (NEAA), 0,05% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1 mM de monotioglicerol (MTG) suplementado com 30 ng / mL de bFGF).
- Verifique as células no dia 2. Se a maioria das células parecer saudável e brilhante, não há necessidade de fazer nada. No entanto, se mais de um terço das células parecerem escuras, substitua o meio (usando a mesma técnica de inclinação da etapa 3.2) por ~ 20 mL de meio de baixo bFGF suplementado com 20 ng / mL de bFGF.
- No dia 3, substitua metade do meio (usando a técnica de inclinação na etapa 3.2) por 20 mL de meio de baixo bFGF suplementado com 10 ng/mL de bFGF.
- No dia 5, substitua metade do meio (usando a técnica de inclinação na etapa 3.2) por 20 mL de meio de indução neural (NIM: DMEM/F12, 1x suplemento de N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL de heparina).
nota: Se houver grandes aglomerados de células ou organoides muito maiores que os outros, eles devem ser removidos da cultura. O tamanho é estimado pela aparência ao microscópio; por exemplo, usando uma ocular com retículo. A maioria dos organoides tem tamanho semelhante (aproximadamente 100 ± 20 μm). Removemos organoides que eram aproximadamente 2x menores ou maiores que os outros.
- Substitua metade do meio (~ 15 mL) (usando a técnica de inclinação) por NIM a cada dois dias.
- Após 3 semanas em cultura, adicione 100x penicilina/estreptomicina ao meio (NIM: DMEM/F12, 1x suplemento N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL de heparina) a uma concentração final de 1x, se desejar. Atualize a mídia a cada dois dias.
nota: Dessa forma, mantivemos os organoides por até 6 meses em cultura.