1. Mesencéfalo ventral e dissecção da medula espinhal
NOTA: Execute todas as etapas a seguir, exceto as etapas 1.1.1−1.1.3 e 1.1.5−1.1.6 sob um estereomicroscópio de dissecação de fluorescência. O tempo total de dissecção por experimento é tipicamente de 3 a 5 h, dependendo da proficiência na técnica de dissecção e do número de neurônios motores necessários para cada experimento.
- Dissecção do mesencéfalo ventral
- Eutanásia de um camundongo prenhe aproximadamente 11,5 dias após a fertilização por gás dióxido de carbono e luxação cervical.
- Pulverize o abdômen completamente com etanol e remova o útero usando uma tesoura de microdissecação estéril e uma pinça de curativo para o polegar. Lave o útero brevemente em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, transfira para a placa de dissecção preenchida com PBS estéril pré-resfriado.
- Remova os embriões positivos para IslMN: GFP (neurônio motor da ilhota: proteína fluorescente verde) cuidadosamente do útero usando uma tesoura de microdissecação estéril, pinça de curativo de polegar e pinça Dumont # 5 em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) gelada sob a luz brilhante do microscópio. Usando uma colher miniperfurada Moria estéril, transfira cada embrião para um poço separado de uma placa de 24 poços preenchida com meio de baixa fluorescência Hibernate-E pré-resfriado suplementado com 1x B27. Mantenha a placa de 24 poços no gelo.
- Transfira um embrião para uma placa de dissecção estéril e cubra-o completamente com solução salina balanceada de Hank (HBSS) estéril gelada.
- Certifique-se de que as etapas de dissecção sejam realizadas sob iluminação de isotiocianato de fluoresceína (FITC) do microscópio. Usando uma pinça, remova a cauda e a face do embrião sem danificar o mesencéfalo (Figura 1Ba). Coloque o embrião de bruços com os membros estendidos por baixo e a cauda apontando para a frente do microscópio, em direção ao dissector (indicado por um asterisco, Figura 1Bb).
- Usando uma pinça, abra o teto do quarto ventrículo para gerar uma pequena abertura. Use esta abertura para prender uma pinça no espaço criado entre o quarto ventrículo e seu teto. Dissecar ao longo da superfície dorsal do embrião rostral ao córtex e lateral à placa do assoalho e à coluna motora (Figura 1Ca, b). Abra o tecido dissecado em livro aberto para revelar os núcleos do neurônio oculomotor (nervo craniano 3 [CN3]) e do neurônio troclear (nervo craniano 4 [CN4]) positivos para GFP.
NOTA: Um pequeno pedaço de tecido do mesencéfalo ventral contendo mesênquima, CN3 e CN4 agora será exposto.
- Separe cuidadosamente o mesencéfalo ventral do embrião e remova o tecido meníngeo usando uma pinça e uma faca de microdissecação. Disseque os núcleos CN3 e CN4 bilaterais positivos para GFP longe da placa de piso e de outros tecidos circundantes negativos para GFP usando uma pinça e uma faca de microdissecação (Figura 1D). Maximize o número de neurônios motores positivos para GFP no tecido excisado, mas evite tocá-los ou danificá-los.
- Se uma coleção de núcleos CN3 e CN4 separados for desejada, corte ao longo da linha média desses dois núcleos (linha pontilhada amarela na Figura 1D). Usando uma pipeta P1000, colete o tecido ventral dissecado do mesencéfalo com HBSS mínimo e coloque-o em um tubo de microcentrífuga rotulado de 1,7 mL cheio de meio de dissecação. Conservar no gelo até à dissociação.
- Continue agrupando mesencéfalos ventrais de embriões adicionais no mesmo tubo até que o número total atenda ao requisito experimental (consulte a etapa 4 para obter o número ideal de células).
NOTA: Uma coleção agrupada de pelo menos 10 mesencéfalos ventrais produzindo aproximadamente 1 x 104 neurônios motores CN3 / CN4 é recomendada porque os tecidos estão sujeitos a estresse durante a dissociação e classificação.
- Dissecção da medula espinhal ventral
- Mantenha o embrião em decúbito ventral com a cabeça voltada para a frente do microscópio, em direção ao dissector. Segure o embrião com uma pinça e insira a ponta do outro par de pinças na parte caudal fechada do quarto ventrículo.
- Abra o resto do rombencéfalo e da medula espinhal dorsalmente em toda a extensão rostrocaudal do embrião. Abra cortando o tecido dorsal, começando do quarto ventrículo e trabalhando em direção ao canal central da medula espinhal caudal usando a pinça como tesoura (Figura 1Ca,b). Tome cuidado para evitar tocar ou danificar a medula espinhal ventral durante este procedimento.
- Segurar o embrião com uma pinça e pinçar a aba do tecido dorsal de cada lado com a outra pinça (Figura 1Ea,b).
NOTA: Os tecidos dorsais excisados contêm pele dorsal, mesênquima, gânglios da raiz dorsal (DRGs), rombencéfalo dorsal e medula espinhal. Remova o máximo possível desses tecidos sem danificar os núcleos do neurônio motor espinhal (SMN), porque eles são adesivos e podem prender SMNs durante a filtragem ou causar entupimento durante a classificação de células ativada por fluorescência (FACS).
- Remova a medula espinhal ventral usando a faca de microdissecção para perfurar diretamente abaixo do SMN positivo para GFP. Levante a medula espinhal ventral com movimentos semelhantes a serras em ambos os lados (Figura 1Fa, b). Corte a medula espinhal ventral flutuante transversalmente diretamente acima de C1, onde o primeiro corno anterior positivo para GFP se projeta (Figura 1G). Além disso, corte transversal no limite superior do membro inferior (Figura 1G). Remova a porção cervical (C1)-lombar (L2-L3) da medula espinhal ventral após este procedimento.
- Coloque o lado dorsal da medula espinhal ventral para cima e segure pressionando o tecido negativo para GFP entre as colunas SMN positivas para GFP com uma pinça. Remova o mesênquima anexado restante, DRGs e medula espinhal dorsal aparando ambos os lados da coluna SMN positiva para GFP com a faca de microdissecção (Figura 1H). Tome cuidado para maximizar os neurônios motores positivos para GFP sem danificá-los.
- Usando uma pipeta P1000, colete o tecido da medula espinhal ventral dissecado com HBSS mínimo e coloque no tubo de microcentrífuga de 1,7 mL marcado com SMN cheio de meio de dissecação. Conservar no gelo até à dissociação. Continue agrupando a medula espinhal ventral de embriões adicionais no mesmo tubo até que o número total atenda aos requisitos experimentais.
nota: Recomenda-se a coleta de pelo menos três medulas espinhais ventrais produzindo aproximadamente 2,1 x 104 SMN porque os tecidos estão sujeitos a estresse durante a dissociação e classificação.
- Colete neurônios motores faciais e extremidades dos embriões de camundongos IslMN: GFP como controles positivos e negativos para GFP para classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), respectivamente. As extremidades são GFP-negativas porque os axônios GFP-positivos dos SMNs ainda não se estenderam para as extremidades nesta idade embrionária.
2. Dissociação de Tecidos
NOTA: O tempo total de dissociação é normalmente de 1,5 h por experimento.
- Alíquotas quentes da solução de papaína e albumina-ovomucóide a 37 °C 30 min antes da dissociação.
- Gire brevemente os tecidos microdissecados em baixa velocidade.
- Usando uma pipeta P100, remova cuidadosamente o máximo possível de Hibernate E sem aspirar tecidos.
NOTA: Certifique-se de remover todo o Hibernate E residual após esta etapa para evitar reduzir a eficácia da dissociação da papaína na próxima etapa.
- Adicionar o volume apropriado de solução de papaína (Tabela 1) a cada um dos tubos de microcentrífuga de 1,7 mL contendo as amostras de tecido microdissecado.
NOTA: O volume apropriado de papaína para a dissociação foi determinado a fim de maximizar a dissociação efetiva e minimizar o estresse nas células.
- Triture suavemente 8x com uma pipeta P200. Execute todas as etapas de trituração suavemente para preservar a viabilidade do neurônio motor.
- Incube os tubos contendo os tecidos por 30 min a 37 ° C, agitando com o dedo 10x a cada 10 min. Triture suavemente cada suspensão 8x com uma pipeta P200 após a incubação. Gire as células a 300 x g por 5 min.
- Para garantir a eficácia da inibição do ovomucoide na próxima etapa, use uma pipeta P1000 para remover e descartar o máximo possível de sobrenadante sem aspirar os tecidos.
- Ressuspenda os pellets no volume apropriado de solução inibidora de albumina-ovomucóide (Tabela 1) triturando suavemente 8x com uma pipeta P200.
- Aguarde 2 minutos para permitir que quaisquer pedaços restantes de tecido não dissociado se depositem no fundo do tubo.
- Colete o máximo de sobrenadante possível sem aspirar tecidos não dissociados usando uma pipeta P200. Transfira o sobrenadante para tubos de microcentrífuga novos de 1,7 mL.
- Se alguns pedaços de tecido permanecerem indissociados após a etapa 2.10, repita as etapas 2.8 a 2.10 para os tecidos não dissociados que permanecem nos tubos de microcentrífuga originais de 1,7 mL para maximizar o rendimento final das células dissociadas e minimizar o estresse nas células dissociadas anteriormente, contidas no sobrenadante da etapa 2.10.
- Gire as células a 300 x g por 5 min. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta P1000.
- Ressuspenda o pellet no volume apropriado de meio de dissecação (Tabela 1) pipetando 8x usando uma pipeta P1000. O volume apropriado de suspensão final foi determinado para que a densidade celular não exceda 107 células/mL, o que pode bloquear o fluxo da máquina de citometria de fluxo, mas também para que as células não sejam excessivamente diluídas, o que resulta em uma velocidade de classificação mais lenta.
- Filtrar as suspensões através de filtros de células de 70 μm para eliminar quaisquer aglomerados grandes ou tecido não digerido. Transfira as suspensões para tubos de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL e guarde no gelo até que seja necessário.
3. Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)
NOTA: Este protocolo foi otimizado usando um classificador FACS equipado com um laser violeta de 15 mw 405 nm, um laser azul de 100 mw 488 nm, um laser laranja de 75 mw 594 nm e um laser vermelho de 40 mw 640 nm. As células foram classificadas como fluido de bainha em PBS estéril sob condições assépticas através de um bico de 100 μm. Para minimizar o estresse celular, a taxa de fluxo foi ajustada para uma pressão de amostra de 1−3, de modo que um máximo de 1.000−4.000 eventos por segundo foram adquiridos. O tempo total do FACS é tipicamente de 1 a 2 h por experimento.
- Configure tensões para dispersão direta e lateral para que a população de células possa ser visualizada corretamente. A configuração de tensões apropriadas para classificação de células é complexa e requer um operador FACS experiente.
- Para distinguir diferentes populações de células, plote as células com base no tamanho, conforme determinado pela Área de Dispersão Direta (FSC-A) versus complexidade interna, conforme determinado pela Área de Dispersão Lateral (SSC-A). Desenhe um portão ao redor das células vivas, conforme indicado na Figura 2Aa e na Figura Ba para excluir detritos e células mortas. Agrupe as células dentro da região fechada como população 1 (P1).
- Para excluir aglomerados e duplicatas de células, plote as células P1 em seguida com base na largura de dispersão lateral (SSC-W) versus a SSC-A. Defina a população de células individuais como população 2 (P2) (Figura 2Ab e Figura Bb).
- Plote as células P2 com base na Largura de Dispersão Direta (FSC-W) versus a FSC-A e coloque a população de células únicas como população 3 (P3) (Figura 2Ac e Figura Bc).
nota: O uso de duas portas consecutivas em 3.3 e 3.4 exclui aglomerados de células e dupletos (FSC-W alto e FSC-A alto).
- Células Gate P3 baseadas em GFP versus aloficocianina (APC). O canal APC detecta autofluorescência. A ativação deste canal evita a captura de células autofluorescentes. Use células GFP-negativas para ajustar a tensão para canais fluorescentes FITC/GFP. Idealmente, posicione os portões para essas populações de células em torno de 102. Selecione os limiares de porta para a população positiva para GFP 4 (P4) individualmente para cada tipo de neurônio motor (Figura 2Ad e Figura Bd).
NOTA: Defina a porta GFP muito mais alta para SMNs do que para CN3s/CN4s para obter uma cultura pura (Figura 2Ad e Figura Bd). Uma porta GFP mais baixa para culturas de SMN leva à contaminação das culturas por neurônios glia e não motores. Isso provavelmente ocorre porque há expressão de GFP de baixo nível em alguns neurônios gliáticos e não motores devido a um promotor com vazamento. A porcentagem de células positivas para GFP em comparação com o total de células é tipicamente de 0,5 a 1,5% para CN3s / CN4s e 1,5 a 2,5% para SMNs. Se a dissecção foi bem-sucedida, esses números podem ser usados como referência para determinar a posição apropriada para a porta positiva para GFP (Figura 2Ae e Figura Be).
- Execute o FACS de acordo com o protocolo do fabricante. Colete células P4 em tubos de microcentrífuga novos de 1,7 mL cheios de 500 μL de meio de cultura de neurônios motores. Guarde no gelo até o revestimento.
nota: Embora as células possam ser classificadas diretamente nos poços, isso resulta em um número ímpar de células por poço. Classifique as células em tubos de microcentrífuga de 1,75 mL e, em seguida, coloque manualmente a placa para obter uma distribuição de revestimento mais uniforme.
4. Cultura de neurônios motores primários purificados
- Diluir as suspensões CN3/CN4 e SMN isoladas por FACS com meio de cultura de neurônios motores pré-aquecido a 37 °C para densidades de 5 x 103 e 1 x 10,4 células/mL, respectivamente.
nota: Um embrião E11.5 produz aproximadamente 1 x 103 CN3 / CN4 e 7 x 103 SMN. No entanto, esses rendimentos dependem fortemente da pureza dos tecidos dissecados, da meticulosidade da dissociação celular e do limiar apropriado das portas GFP durante o FACS.
- Transferir placas de 96 poços pré-revestidas com poli D-lisina (PDL) e laminina da incubadora de cultura de tecidos a 37 °C para a capela de fluxo laminar e aspirar a laminina de cada poço. Use placas e lamínulas imediatamente, sem lavar.
- Adicione 200 μL de suspensões diluídas de CN3/CN4 e SMN em cada poço de placas de 96 poços revestidas com PDL/laminina. As densidades celulares finais devem ser de 1 x 103 e 2 x 103 células/poço para CN3/CN4 e SMN, respectivamente.
nota: A densidade inicial de plaqueamento de SMNs em placas de 96 poços (2 x 103 células/poço) é o dobro da de CN3s/CN4s (1 x 103 células/poço) para obter números e densidades de neurônios motores finais semelhantes em 2 e 9 dias in vitro (DIV) (4−6 x 102 e 2−4 x 102 células por poço, respectivamente).
- Neurônios de cultura em uma incubadora de CO2 a 37 °C, 5%.
- Alimente os neurônios a cada 5 dias, removendo metade do meio antigo (100 μL) e substituindo pelo mesmo volume de meio de cultura de neurônios motores frescos. Certifique-se de que os processos neuronais se tornem visíveis em 1 DIV e se tornem mais espessos e mais longos em 14 DIV (Figura 3). Os corpos celulares neuronais tornam-se aumentados e tendem a se agregar em culturas de longo prazo, particularmente para SMNs (Figura 3).
NOTA: Execute todas as trocas de meio e solução deixando metade do volume original do meio para evitar o descolamento das células cultivadas. Isso inclui etapas de fixação e imunocitoquímica (ICC). Se todos os meios forem removidos, independentemente de quão suavemente, a maioria das células se desprenderá e será lavada.
