Manuseio de culturas de células-tronco neuronais em uma instalação de produção de células

Resumo

Fonte: Stover, A. E., et al,. Cultura de células-tronco pluripotentes e neurais humanas em um sistema de cultura de células fechado para pesquisa básica e pré-clínica. J. Vis. Exp. (2016).

O vídeo descreve o procedimento para manter um ambiente controlado em uma estação de trabalho de cultura de células para o crescimento e manutenção de células-tronco neuronais. Esses procedimentos envolvem o estabelecimento de condições de câmara, protocolos de limpeza e preparação de meios, mantendo assim a máxima esterilidade e reprodutibilidade e substituindo os métodos tradicionais.

Protocolo

1. Configuração inicial

1. Configurando concentrações de gás e temperatura
   1. Usando o software, clique na guia "Convidado" no canto superior esquerdo da interface gráfica. Faça login no sistema usando um nome de usuário e senha designados. Certifique-se de que cada usuário tenha seu nome de usuário e senha.
   2. Clique em um módulo para ajustar (Figura 1). Na nova janela que exibe as configurações atuais, clique no valor do ponto de ajuste de O₂ existente abaixo de "Ponto de ajuste" e insira o nível de concentração de O₂ necessário para este módulo. Insira 5% O₂ se células-tronco pluripotentes forem cultivadas ou manipuladas neste módulo e 9% O₂ se células-tronco neurais forem cultivadas ou manipuladas. Clique na marca de seleção verde para confirmar o ponto de ajuste.
      nota: Dois módulos não são ajustáveis a gás: a capela laminar e a câmara do microscópio. As concentrações de gás na capela de fluxo laminar são atmosféricas, enquanto as da câmara de processo mantêm passivamente as da câmara do microscópio.
   3. Repita esta etapa para CO₂. Insira um ponto de ajuste de 5% CO₂ para todos os módulos, exceto para as câmaras tampão, que se ajustam apenas para O₂.
   4. Monitore as concentrações atuais de gás rotuladas como "valores de processo" para garantir que atinjam os novos pontos de ajuste.
   5. Ajuste os pontos de ajuste de gás de todos os módulos para os valores apropriados. Combine os níveis de CO₂ e O₂ das câmaras que serão expostas umas às outras. Por exemplo, ajuste a câmara de processo para 5% O₂ antes de abrir uma incubadora que cultiva células a 5% O₂. Além disso, mude para 5% O₂ em qualquer câmara tampão usada para adicionar itens à câmara de processo durante esse período.
   6. Ajuste a temperatura da câmara de processo para 37 °C usando a mesma tela para ajustes de gás. Além disso, a temperatura do piso da câmara de processo deve ser ajustada para 37 °C.
   7. Clique nos bancos de módulos de incubação abaixo de cada incubadora. Ajustar a temperatura dos bancos para 37 °C.
2. Operação de câmaras tampão
   1. Reúna todos os suprimentos necessários para a tarefa em questão (alimentação, divisão, coloração, etc.) no início para evitar atrasos no fluxo de trabalho. Pulverize generosamente todos os materiais com etanol 70% e deixe-os secar na coifa laminar. Não borrife frascos ou placas de células - limpe-os suavemente com uma esponja de gaze estéril saturada com etanol a 70%.
   2. Certifique-se de que as portas externa e interna da câmara tampão estejam bem fechadas. Em seguida, abra a porta externa e coloque os itens dentro.
   3. Feche a porta externa. Selecione o módulo de buffer no software e clique na guia do fator de diluição. Insira um na caixa de fator logarítmica. Clique em start.
      Nota: Um "fator de diluição" significa que a atmosfera do módulo tampão será evacuada e substituída uma vez por gás limpo e filtrado por HEPA.
   4. Assim que a interface gráfica parar de piscar o "fator de diluição", abra a porta interna da câmara tampão e traga os materiais para dentro da câmara de processo.
      Cuidado: Não permita que as portas interna e externa sejam abertas simultaneamente e não abra a porta interna se a câmara tampão não tiver sofrido um fator de diluição.
   5. Primeiro, remova os itens da câmara de processo e certifique-se de que a câmara tampão tenha sido submetida a um fator de diluição. Em seguida, abra a porta interna, coloque os itens a serem removidos dentro e feche a porta interna. Em seguida, abra a porta externa e retire os itens.
      Nota: Não se deve executar um factor de diluição antes de abrir a porta exterior.

2. Introdução e alimentação de células

1. Configuração da incubadora
   1. Coloque 3 placas de Petri na panela de água na base de cada incubadora. Encha esses pratos com água estéril, não enchendo diretamente a panela. Mantenha o nível de água nessas placas, pois elas são essenciais para manter o ponto de ajuste da umidade relativa (UR) das incubadoras.
   2. Na interface gráfica, clique na incubadora. Sob o ponto de ajuste, clique no valor de umidade relativa (UR) existente e insira 85%. Clique na marca de seleção verde para aceitar este valor.
2. Preparação da unidade de produção de células para células
   1. Se ainda não tiver feito isso, ajuste as câmaras tampão, a câmara de processo e uma incubadora para os pontos de ajuste de gás necessários para o tipo de célula que está sendo introduzida.
   2. Limpe a superfície da câmara de processo com gaze estéril e um desinfetante não inflamável. Não use nenhum desinfetante à base de ácido peracético; Em um sistema fechado, os vapores fortes e persistentes são tóxicos para as células de mamíferos. Em vez disso, use produtos à base de cloreto de benzalcônio.
   3. Continue desinfetando. Limpe as luvas e as superfícies comumente tocadas, como maçanetas. Use o desinfetante completamente, mas com moderação, pois o excesso de líquido na câmara de processo contribuirá para a umidade, condensação e possível crescimento microbiano.
   4. Limpe a superfície da capela de fluxo laminar e da câmara tampão com etanol a 70% e deixe secar. Coloque o frasco ou placa de células (no nosso caso, PSCs (células-tronco pluripotentes) ou NSCs (células-tronco neurais)) no capô e limpe brevemente sua superfície externa com uma esponja de gaze estéril saturada com etanol.
   5. Colocar o balão ou a placa na câmara tampão e executar um factor de diluição (passo 1.2.3).
   6. Após a conclusão do factor de diluição, desloque imediatamente o balão ou a placa para a incubadora adequada. Como as incubadoras estão na parte de trás da câmara de processo, puxe uma prateleira para dentro da câmara de processo para a colocação das células. Evite abrir as portas da incubadora desnecessariamente ou por longos períodos, pois o ar da câmara de processo é muito seco em comparação com o das incubadoras e resultará em uma perda significativa de umidade na incubadora.
3. Alimentando culturas de células
   1. Reúna componentes médios, como pipetas sorológicas, pipetador eletrônico, gaze e desinfetante. Além disso, reúna um recipiente de resíduos para o meio de cultura de células gasto, mas não o encha com alvejante. Traga os materiais para a câmara de processo através de uma câmara tampão, conforme descrito na Seção 1.2. Organize os materiais para permitir um espaço de trabalho ideal. Evite colocar itens que não estão sendo usados no centro da câmara de processo.
   2. Deixe o recipiente de mídia ligeiramente destampado para permitir que o meio se equilibre com os níveis de CO₂ e O₂ presentes no sistema. Alguns fabricantes de meios PSC indicam não aquecer os meios a 37 ºC; Em caso afirmativo, use uma câmara tampão para equilibrar o meio. Deixe o meio se equilibrar por 20 min.
   3. Remova o meio antigo dos poços usando uma pipeta estereológica apropriada e um pipetador eletrônico. Para PSCs, remova tudo, exceto uma pequena quantidade restante do meio antigo para evitar a dessecação durante o processo de alimentação. Para NSCs, remova metade do meio antigo. Pipetar os resíduos para o recipiente de resíduos.
   4. Coloque a pipeta usada de volta em seu invólucro original e mova-a para o lado da câmara de processo ou para uma câmara tampão designada para remoção de resíduos. Com uma pipeta sorológica estéril fresca, adicione meio fresco às placas de cultura de células e coloque as placas de volta na incubadora designada.
   5. No final da alimentação, borrife gaze com desinfetante e limpe completamente o piso e as maçanetas das portas da câmara de processo. Se várias linhagens celulares estiverem sendo cultivadas no sistema, esterilize entre a alimentação de cada linhagem celular. Isso ajuda a minimizar o risco de contaminação cruzada.
   6. Remova resíduos ou outros itens desnecessários através de uma das câmaras de proteção após a conclusão.

3. Divisão de culturas de células

1. Passagem enzimática de PSCs ou NSCs
   1. Reúna todos os itens necessários para a passagem. Isso inclui tampão de dissociação de células, enzimas ou células não enzimáticas (o último é apenas para NSCs), DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco), placas ou frascos, matriz extracelular (MEC), tubos cônicos e pipetas sorológicas. Traga-os para o sistema usando uma câmara tampão.
   2. Cubra as placas ou frascos novos com ECM, conforme descrito anteriormente 9,10. Alguns ECMs - como os derivados de linhagens celulares de sarcoma de camundongo - são líquidos apenas entre 4 e 15 °C, portanto, use um bloco frio esterilizado ou uma bolsa de gelo em gel para manter o ECM frio enquanto trabalha na câmara de processo aquecida.
   3. Retire o meio gasto da cultura e deite-o no recipiente de lixo.
   4. Enxágue a superfície do alvéolo ou do frasco com 1 ml de DPBS/alvéolo e elimine o DPBS.
   5. Adicione 1 a 2 ml de enzima quente a cada poço. Apenas culturas muito densas requerem 2 ml.
   6. Mova imediatamente a placa ou frasco de cultura para a câmara do microscópio e observe a cultura. Observe os sinais de células individuais começando a se soltar do prato. Não espere até que as células flutuem em suspensão antes de prosseguir para a próxima etapa.
   7. Retorne as células para a câmara de processo principal. Usando uma pipeta sorológica de 5 ml, adicione 4 ml de DPBS para cada 1 ml de enzima e, em seguida, pipete com força para cima e para baixo para desalojar as células da superfície do poço. Se estiver passando por vários poços dentro de uma placa de paredes múltiplas, adicione o DPBS a cada poço antes de desalojar as células dos poços individuais.
   8. Transfira a enzima e a suspensão de células PBS para um tubo cônico de tamanho apropriado.
   9. Se uma centrífuga não estiver disponível na instalação de produção de células, feche bem o tubo cônico, coloque-o em uma câmara tampão e feche a porta.
   10. Remova o tubo cônico da câmara tampão do lado do fluxo laminar e gire as células a 100 x g por 5 min em RT.
   11. Pulverize o tubo cônico com etanol a 70% e leve-o para a câmara de processo usando uma câmara tampão e fator de diluição.
   12. Pipetar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 ml de meio PSC ou NSC. Se as CEPs estiverem passando, inclua o inibidor de ROCK (proteína quinase associada a Rho) no meio a uma concentração de 10 μM.
   13. Conte as células usando um hemocitômetro e determine os poços ou placas necessários. Placa PSCs a 5 x 10⁴ - 1 x 10⁵ células/cm². Divida os NSCs na proporção de 1:2.
       Nota: Os NSCs geralmente se aglomeram e resistem à contagem precisa em um hemocitômetro.
   14. Se a criopreservação das células for necessária, certifique-se de que todos os suprimentos e meios de congelamento sejam preparados e colocados dentro da câmara de processo. O DMSO (Dimetilsulfóxido) é muito tóxico para as células a 37 ºC, por isso funciona rapidamente. Manter o recipiente de congelação revestido com isopropanol em RT na capela de fluxo laminar. Uma vez que os frascos de criopreservação estejam cheios e selados, remova-os imediatamente da câmara de processo, passando-os por uma câmara tampão.
2. Passagem manual de PSCs
   1. Confirme se a cultura precisa ser passada, conforme descrito anteriormente. Em caso afirmativo, prepare novas placas ou frascos revestidos com matriz extracelular. Em seguida, mude totalmente o meio.
   2. Limpe a câmara do microscópio com gaze estéril umedecida com uma quantidade moderada de desinfetante não inflamável - muito resultará em embaçamento excessivo. Limpe apenas as luvas, a área do piso e o palco. Traga várias pontas de pipeta de 200 μl ou 1.000 μl embaladas individualmente para a câmara.
   3. Traga a placa de PSCs para a câmara do microscópio, remova a tampa e coloque-a voltada para baixo no chão recém-limpo. Deixar a tampa para cima expõe a parte inferior diretamente às correntes de ar e à contaminação potencial.
   4. Desembrulhe a ponta de uma pipeta e, usando o microscópio para visualizar a cultura, separe as colônias com boa morfologia usando a ponta da pipeta.
      Nota: A ponta da pipeta pode ser anexada a uma pipeta se o usuário individual achar isso mais confortável.
   5. Recoloque a tampa da placa e mova a placa de volta para a câmara de processo.
   6. Pipete o excesso de ECM da nova placa e transfira o meio da placa antiga (contendo as peças da colônia em suspensão) para a nova placa. Se o prato antigo ainda contiver colônias que não estão prontas para serem colhidas, alimente-as também.

Resultados

Figura 1. Interface gráfica para a instalação de produção de células. (A) A representação gráfica do CPF é a tela padrão e corresponde ao desenho CAD mostrado na Figura 3. Um clique do mouse sobre o Módulo Buffer 1 abre sua tela de controle (B), onde os valores de O₂ são definidos para corresponder à câmara de processamento. Da mesma forma, clicar na Câmar...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema Xvivo	Biospherix	feito sob medida
Software Xvivo	Biospherix	Versão i.o.2.1.2.1
Coletor de O2	Amico	P-M2H-C3-S-U-OXY
Coletor de CO2	Amico	M2H-C3-D-U-CO2
Coletor N2	Inovador Ocidental	CTM75-7-2-2-BM
Gás O2
Gás CO2
Gás N2
Placa de Petri
Água
Gaze estéril
70% de etanol	BDH	BDH1164-4LP
desinfetante à base de cloreto de benzalcônio
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco
Tampão de dissociação celular baseado em Hank	Tecnologias da Vida	13150-016
2mL de pipeta sorológica	VWR	89130-894
5mL de pipeta sorológica	Plásticos Olympus	12-102
10mL de pipeta sorológica	Plásticos Olympus	12-104
25mL de pipeta sorológica	Plásticos Olympus	12-106
50mL de pipeta sorológica	Plásticos Olympus	12-107
Placa de 6 poços	Corning	353046
Pontas de pipeta de 20 litros	Eppendorf	22491130
Pontas de pipeta de 200 litros	Eppendorf	22491148
1000 pontas de pipeta	Eppendorf	22491156
Microscópio com câmera DP21 e fluorescência	Corporação Olympus	CKX41
Sódio tampolado com fosfato	Hyclone	Pedido 9236
Dimetilsulfóxido	Protide	Pág. 1130
Luvas