A linha de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC), HPS1006, foi fornecida pelo RIKEN BRC por meio do Projeto Nacional de Bio-Recursos do MEXT / AMED, Japão.
1. Indução da diferenciação de hiPSC em células progenitoras endoteliais (EPCs)
- Placas e reagentes revestidos com matriz extracelular (ECM)
- Prepare placas de 12 poços revestidas com matriz de membrana basal aliquotando 2,5 mg de gel de matriz em tubos de centrífuga de 50 mL para armazenamento a -20 °C por até 6 meses. Adicione 30 mL de meio / nutriente modificado por Dulbecco frio F-12 (DMEM / F12), que foi mantido em uma geladeira (4 ° C), no tubo. Misturar delicadamente pipetando até que o gel tenha descongelado e, em seguida, adicionar 500 μL da solução a cada alvéolo da placa de 12 poços. Coloque a placa em uma incubadora (37 °C, 5% CO2) por pelo menos 1 h.
nota: O gel da matriz da membrana basal é sensível à temperatura e deve ser manuseado de acordo com as instruções do fabricante para alíquota e revestimento da placa. A concentração de proteínas da matriz extracelular pode variar entre os lotes. Para garantir a precisão, a concentração exata deve ser mencionada na folha de certificado de qualidade do lote específico, usando o número do lote. Por exemplo, se a concentração exata for de 10,0 mg/mL, use 250 μL de gel para um total de 2,5 mg.
- Prepare a solução-mãe do inibidor da rhoquinase (ROCK) dissolvendo o inibidor de ROCK em água estéril até uma concentração de 10 mM (Tabela 1). Alicotar a solução de reserva em volumes de 100-200 μL e conservá-la a -20 °C para evitar ciclos de congelamento e descongelamento.
- Fazer uma solução-mãe de ácido L-ascórbico a 100 mg/ml dissolvendo 5 g de ácido L-ascórbico em 50 ml de água estéril e conservar a -20 °C (Tabela 1). Adicione 6,25 mL de glutamina e 305 μL de solução estoque de ácido L-ascórbico em 500 mL de DMEM / F12 avançado para fazer um meio LaSR (Tabela 1). Conservar a 2-8 °C até 2 semanas.
- Preparar CHIR99021 solução dissolvendo CHIR99021 em dimetilsulfóxido não diluído (DMSO) até uma concentração final de 10 mM (quadro 1). Alicotar a solução em volumes de 100-200 μL para evitar ciclos de congelamento e descongelamento e armazenar a -20 °C por até 1 ano. Conservar alíquotas de trabalho da solução-mãe a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.
- Prepare o meio DMEM/F12-10 adicionando 50 mL de soro fetal bovino inativado pelo calor a 450 mL de DMEM/F12. Armazene o meio a 2-8 °C por até 1 mês (Tabela 1).
- Prepare o tampão de fluxo-1 adicionando 33,3 mL de albumina de soro bovino (BSA) a 7,5% a 467 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) de Dulbecco (Tabela 1). Conservar a 2-8 °C até 6 meses.
- Semeadura de hiPSCs singularizados e expansão para diferenciação de EPC (Dia -3 ao Dia -1)
- Comece a diferenciação quando as colônias de hiPSC em uma placa de 6 poços não mostrarem diferenciação espontânea e tiverem a densidade apropriada para a passagem, normalmente em torno de 80% de confluência (2,5-3,5 x 106 células). Monitore cuidadosamente as células espontaneamente diferenciadas ao microscópio para garantir se várias passagens são necessárias para eliminar as células não diferenciadas. Consulte a nota fornecida abaixo da etapa 1.4.15 para obter informações sobre o meio de cultura celular e a matriz extracelular.
- Aspire o meio e adicione 1 mL de reagente de dissociação aos alvéolos e incube por 5-7 min a 37 ° C. Dissocie e singularize as células pipetando a solução de reagente de dissociação suavemente sobre as superfícies dos poços duas ou três vezes.
- Transfira as células destacadas para um tubo de 15 mL contendo 4 mL de meio de manutenção hiPSC e ressuspenda as células completamente. Reserve uma alíquota de 10 μL para contagem de células.
- Pulverize as células centrifugando por 5 min a 200 x g a 20-25 ° C. Conte as células e calcule o volume necessário para atingir uma densidade apropriada de hiPSCs (75-400 x 103 por poço) em uma placa de 12 poços revestida com matriz de membrana basal (etapa 1.1.1).
- Aspire a solução de revestimento dos poços e adicione 1 mL de meio hiPSC contendo 10 μM de inibidor de ROCK em cada poço (diluição 1:1.000). Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e dissociar o pellet em 1 ml de meio hiPSC.
- Adicionar o volume necessário de hiPSC, determinado no passo 1.2.4, a cada alvéolo da placa de 12 poços. Duas a quatro placas de 12 poços podem ser suficientes para diferenciar um clone hiPSC. Consulte a etapa 1.2.4 para determinar o número de placas necessárias para a semeadura de células.
- Coloque a placa em uma incubadora (37 °C, 5% CO2). Distribua uniformemente as células deslizando suavemente a placa para frente e para trás e depois de um lado para o outro na incubadora.
- No dia seguinte (ou seja, Dia -2), troque o meio por 2 mL de meio de manutenção hiPSC sem inibidor de ROCK. No dia seguinte (Dia -1), troque o meio por 2 mL de meio de manutenção hiPSC fresco.
- Indução de EPCs com o inibidor da glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3) CHIR99021 (Dia 0 ao Dia 5)
- No Dia 0, substitua o meio de manutenção hiPSC em cada poço por 2 mL de meio LaSR contendo 8 μM CHIR99021.
- No Dia 1, aspire o meio e adicione 2 mL de meio LaSR fresco contendo 8 μM CHIR99021.
- Nos dias 2, 3 e 4, substitua o meio por 2 mL de meio LaSR fresco sem CHIR99021.
- Classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) para purificar CPE CD31+ (Dia 5)
- No dia 5, aspire o meio e adicione 1 mL de reagente de dissociação a cada poço, antes de incubar por 6-8 min a 37 ° C.
- Dissociar e singularizar as células com uma micropipeta e passar por um filtro de células de 40 μm para filtrar a suspensão em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de meio DMEM/F12-10. Filtre a suspensão celular coletada de mais de duas placas de 12 poços em pelo menos dois tubos de 50 mL.
- Pare a reação de digestão adicionando meio DMEM/F12-10 (até 50 mL). Pipetar bem e reservar 10 μL para a contagem das células. Pulverizar as células centrifugando durante 5 min a 200 x g a 20-25 °C.
- Depois de remover o sobrenadante, adicione 10 mL de meio DMEM/F12-10 e transfira a suspensão celular para tubos novos de 15 mL. Pulverizar as células centrifugando durante 5 min a 200 x g a 20-25 °C.
- Aspire o sobrenadante e ressuspenda no tampão de fluxo-1 a uma densidade de 1,0 x 107 células por 100 μL de tampão.
- Adicione o reagente bloqueador do receptor Fc (FcR) na proporção de 1:100 e incube por 5 min antes de adicionar o anticorpo CD31 marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) diluído a 1:200. Incubar a suspensão durante 30 min no escuro a 20-25 °C.
- Adicionar 10 mL de tampão de fluxo-1, reservando 10 μL da suspensão para análise de citometria de fluxo para determinar a fração de células CD31+ (Figura 1).
- Pulverizar as células centrifugando a 200 x g durante 5 min a 20-25 °C. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda a uma densidade de 1,0 x 107 células por 100 μL de solução de tampão de fluxo-1. Adicione o coquetel de seleção FITC (5 μL por 100 μL de suspensão celular). Misture bem pipetando e incube no escuro por 15 min a 20-25 °C.
- Adicione 5 μL de nanopartículas magnéticas por 100 μL de suspensão celular, pipete bem e incube no escuro por 10 min a 20-25 °C.
- Transfira a suspensão celular para um tubo de citometria de fluxo de 5 mL e adicione tampão de fluxo-1 para obter um volume total de 2,5 mL. Coloque o tubo de citometria de fluxo no ímã por 5 min.
- Em um movimento contínuo, inverta o ímã e decanta a suspensão celular contendo células que não foram marcadas com o anticorpo FITC-CD31. Mantenha o ímã e o tubo na posição invertida por 2-3 s e, em seguida, remova o líquido restante. Aspire todas as gotículas na borda do tubo antes de retornar o tubo para a posição vertical.
- Pegue o tubo de citometria de fluxo do ímã e adicione 2,5 mL de tampão de fluxo-1 para lavar as células CD31 + restantes. Ressuspenda as células pipetando suavemente as células para cima e para baixo duas ou três vezes. Coloque o tubo de fluxo no ímã por 5 min.
- Repita as etapas 1.4.11-1.4.12 três vezes e, em seguida, a etapa 1.4.11 mais uma vez para um total de quatro lavagens.
- Remova o tubo de fluxo do ímã e adicione a quantidade indicada de um meio adequado (por exemplo, meio livre de soro endotelial humano [hECSR] para cultura CE estendida ou meio de congelamento para congelamento) ao tubo para ressuspender as células CD31 + purificadas. Reserve duas alíquotas de 10 μL da suspensão, uma para contagem de células e a segunda para realizar a análise de citometria de fluxo para avaliar a pureza das células CD31+ em amostras pós-MACS (figura 1). Se não estiver disponível imediatamente um citómetro de fluxo, conservar a alíquota a 4 °C até à análise.
- Congele os EPCs CD31+ neste ponto.
nota: Placas de 12 poços revestidas com vitronectina e o meio de manutenção hiPSC mais estável (mTeSR plus) podem ser usados no lugar de placas revestidas com matriz de membrana basal e meio de manutenção hiPSC (mTeSR1). Para preparar placas de 12 poços revestidas com vitronectina, dilua a vitronectina com tampão de diluição até uma concentração final de 10 μg / mL e, em seguida, transfira 500 μL da solução diluída para cada poço das placas de 12 poços. Deixe as placas a 20-25 °C por pelo menos 1 h. A densidade de semeadura de hiPSCs singularizados é comparável à usada para placas revestidas com matriz de membrana basal. A alteração do meio de cultura ou da composição da matriz pode afetar a proliferação e a diferenciação espontânea de hiPSCs, que normalmente requerem 1-2 semanas para se adaptar a novas condições de cultura. Se o meio de manutenção hiPSC mais estável for usado para manutenção hiPSC, este meio pode ser usado para diferenciação EPC em vez do meio de manutenção hiPSC. Nesse caso, o meio de manutenção hiPSC mais estável deve ser trocado no Dia -2 para remover o inibidor de ROCK, e a troca no Dia -1 pode ser ignorada.
