Purificação de células precursoras endoteliais CD31+ usando classificação de células ativadas por magnetismo

Resumo

Fonte: Matsuo, K., et al. Diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em células semelhantes a células endoteliais microvasculares cerebrais com fenótipo imunológico maduro. J. Vis. Exp. (2023).

Este vídeo demonstra uma técnica para purificar células progenitoras endoteliais CD31⁺ (EPCs) de uma cultura usando classificação de células ativadas por magnetismo (MACS). A suspensão celular é tratada com um anticorpo conjugado com fluoróforo que se liga ao CD31 nas CPEs. Completar a marcação de EPCs CD31⁺ envolve a adição de um complexo de anticorpos, que se liga aos fluoróforos, e uma nanopartícula magnética revestida com polímero, que se liga ao complexo de anticorpos. As células marcadas são então purificadas usando um campo magnético, descartando quaisquer células CD31^-.

Protocolo

A linha de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC), HPS1006, foi fornecida pelo RIKEN BRC por meio do Projeto Nacional de Bio-Recursos do MEXT / AMED, Japão.

1. Indução da diferenciação de hiPSC em células progenitoras endoteliais (EPCs)

1. Placas e reagentes revestidos com matriz extracelular (ECM)
   1. Prepare placas de 12 poços revestidas com matriz de membrana basal aliquotando 2,5 mg de gel de matriz em tubos de centrífuga de 50 mL para armazenamento a -20 °C por até 6 meses. Adicione 30 mL de meio / nutriente modificado por Dulbecco frio F-12 (DMEM / F12), que foi mantido em uma geladeira (4 ° C), no tubo. Misturar delicadamente pipetando até que o gel tenha descongelado e, em seguida, adicionar 500 μL da solução a cada alvéolo da placa de 12 poços. Coloque a placa em uma incubadora (37 °C, 5% CO₂) por pelo menos 1 h.
      nota: O gel da matriz da membrana basal é sensível à temperatura e deve ser manuseado de acordo com as instruções do fabricante para alíquota e revestimento da placa. A concentração de proteínas da matriz extracelular pode variar entre os lotes. Para garantir a precisão, a concentração exata deve ser mencionada na folha de certificado de qualidade do lote específico, usando o número do lote. Por exemplo, se a concentração exata for de 10,0 mg/mL, use 250 μL de gel para um total de 2,5 mg.
   2. Prepare a solução-mãe do inibidor da rhoquinase (ROCK) dissolvendo o inibidor de ROCK em água estéril até uma concentração de 10 mM (Tabela 1). Alicotar a solução de reserva em volumes de 100-200 μL e conservá-la a -20 °C para evitar ciclos de congelamento e descongelamento.
   3. Fazer uma solução-mãe de ácido L-ascórbico a 100 mg/ml dissolvendo 5 g de ácido L-ascórbico em 50 ml de água estéril e conservar a -20 °C (Tabela 1). Adicione 6,25 mL de glutamina e 305 μL de solução estoque de ácido L-ascórbico em 500 mL de DMEM / F12 avançado para fazer um meio LaSR (Tabela 1). Conservar a 2-8 °C até 2 semanas.
   4. Preparar CHIR99021 solução dissolvendo CHIR99021 em dimetilsulfóxido não diluído (DMSO) até uma concentração final de 10 mM (quadro 1). Alicotar a solução em volumes de 100-200 μL para evitar ciclos de congelamento e descongelamento e armazenar a -20 °C por até 1 ano. Conservar alíquotas de trabalho da solução-mãe a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.
   5. Prepare o meio DMEM/F12-10 adicionando 50 mL de soro fetal bovino inativado pelo calor a 450 mL de DMEM/F12. Armazene o meio a 2-8 °C por até 1 mês (Tabela 1).
   6. Prepare o tampão de fluxo-1 adicionando 33,3 mL de albumina de soro bovino (BSA) a 7,5% a 467 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) de Dulbecco (Tabela 1). Conservar a 2-8 °C até 6 meses.
2. Semeadura de hiPSCs singularizados e expansão para diferenciação de EPC (Dia -3 ao Dia -1)
   1. Comece a diferenciação quando as colônias de hiPSC em uma placa de 6 poços não mostrarem diferenciação espontânea e tiverem a densidade apropriada para a passagem, normalmente em torno de 80% de confluência (2,5-3,5 x 10⁶ células). Monitore cuidadosamente as células espontaneamente diferenciadas ao microscópio para garantir se várias passagens são necessárias para eliminar as células não diferenciadas. Consulte a nota fornecida abaixo da etapa 1.4.15 para obter informações sobre o meio de cultura celular e a matriz extracelular.
   2. Aspire o meio e adicione 1 mL de reagente de dissociação aos alvéolos e incube por 5-7 min a 37 ° C. Dissocie e singularize as células pipetando a solução de reagente de dissociação suavemente sobre as superfícies dos poços duas ou três vezes.
   3. Transfira as células destacadas para um tubo de 15 mL contendo 4 mL de meio de manutenção hiPSC e ressuspenda as células completamente. Reserve uma alíquota de 10 μL para contagem de células.
   4. Pulverize as células centrifugando por 5 min a 200 x g a 20-25 ° C. Conte as células e calcule o volume necessário para atingir uma densidade apropriada de hiPSCs (75-400 x 10³ por poço) em uma placa de 12 poços revestida com matriz de membrana basal (etapa 1.1.1).
   5. Aspire a solução de revestimento dos poços e adicione 1 mL de meio hiPSC contendo 10 μM de inibidor de ROCK em cada poço (diluição 1:1.000). Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e dissociar o pellet em 1 ml de meio hiPSC.
   6. Adicionar o volume necessário de hiPSC, determinado no passo 1.2.4, a cada alvéolo da placa de 12 poços. Duas a quatro placas de 12 poços podem ser suficientes para diferenciar um clone hiPSC. Consulte a etapa 1.2.4 para determinar o número de placas necessárias para a semeadura de células.
   7. Coloque a placa em uma incubadora (37 °C, 5% CO²). Distribua uniformemente as células deslizando suavemente a placa para frente e para trás e depois de um lado para o outro na incubadora.
   8. No dia seguinte (ou seja, Dia -2), troque o meio por 2 mL de meio de manutenção hiPSC sem inibidor de ROCK. No dia seguinte (Dia -1), troque o meio por 2 mL de meio de manutenção hiPSC fresco.
3. Indução de EPCs com o inibidor da glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3) CHIR99021 (Dia 0 ao Dia 5)
   1. No Dia 0, substitua o meio de manutenção hiPSC em cada poço por 2 mL de meio LaSR contendo 8 μM CHIR99021.
   2. No Dia 1, aspire o meio e adicione 2 mL de meio LaSR fresco contendo 8 μM CHIR99021.
   3. Nos dias 2, 3 e 4, substitua o meio por 2 mL de meio LaSR fresco sem CHIR99021.
4. Classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) para purificar CPE CD31+ (Dia 5)
   1. No dia 5, aspire o meio e adicione 1 mL de reagente de dissociação a cada poço, antes de incubar por 6-8 min a 37 ° C.
   2. Dissociar e singularizar as células com uma micropipeta e passar por um filtro de células de 40 μm para filtrar a suspensão em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de meio DMEM/F12-10. Filtre a suspensão celular coletada de mais de duas placas de 12 poços em pelo menos dois tubos de 50 mL.
   3. Pare a reação de digestão adicionando meio DMEM/F12-10 (até 50 mL). Pipetar bem e reservar 10 μL para a contagem das células. Pulverizar as células centrifugando durante 5 min a 200 x g a 20-25 °C.
   4. Depois de remover o sobrenadante, adicione 10 mL de meio DMEM/F12-10 e transfira a suspensão celular para tubos novos de 15 mL. Pulverizar as células centrifugando durante 5 min a 200 x g a 20-25 °C.
   5. Aspire o sobrenadante e ressuspenda no tampão de fluxo-1 a uma densidade de 1,0 x 10⁷ células por 100 μL de tampão.
   6. Adicione o reagente bloqueador do receptor Fc (FcR) na proporção de 1:100 e incube por 5 min antes de adicionar o anticorpo CD31 marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) diluído a 1:200. Incubar a suspensão durante 30 min no escuro a 20-25 °C.
   7. Adicionar 10 mL de tampão de fluxo-1, reservando 10 μL da suspensão para análise de citometria de fluxo para determinar a fração de células CD31⁺ (Figura 1).
   8. Pulverizar as células centrifugando a 200 x g durante 5 min a 20-25 °C. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda a uma densidade de 1,0 x 10⁷ células por 100 μL de solução de tampão de fluxo-1. Adicione o coquetel de seleção FITC (5 μL por 100 μL de suspensão celular). Misture bem pipetando e incube no escuro por 15 min a 20-25 °C.
   9. Adicione 5 μL de nanopartículas magnéticas por 100 μL de suspensão celular, pipete bem e incube no escuro por 10 min a 20-25 °C.
   10. Transfira a suspensão celular para um tubo de citometria de fluxo de 5 mL e adicione tampão de fluxo-1 para obter um volume total de 2,5 mL. Coloque o tubo de citometria de fluxo no ímã por 5 min.
   11. Em um movimento contínuo, inverta o ímã e decanta a suspensão celular contendo células que não foram marcadas com o anticorpo FITC-CD31. Mantenha o ímã e o tubo na posição invertida por 2-3 s e, em seguida, remova o líquido restante. Aspire todas as gotículas na borda do tubo antes de retornar o tubo para a posição vertical.
   12. Pegue o tubo de citometria de fluxo do ímã e adicione 2,5 mL de tampão de fluxo-1 para lavar as células CD31 ⁺ restantes. Ressuspenda as células pipetando suavemente as células para cima e para baixo duas ou três vezes. Coloque o tubo de fluxo no ímã por 5 min.
   13. Repita as etapas 1.4.11-1.4.12 três vezes e, em seguida, a etapa 1.4.11 mais uma vez para um total de quatro lavagens.
   14. Remova o tubo de fluxo do ímã e adicione a quantidade indicada de um meio adequado (por exemplo, meio livre de soro endotelial humano [hECSR] para cultura CE estendida ou meio de congelamento para congelamento) ao tubo para ressuspender as células CD31 ⁺ purificadas. Reserve duas alíquotas de 10 μL da suspensão, uma para contagem de células e a segunda para realizar a análise de citometria de fluxo para avaliar a pureza das células CD31⁺ em amostras pós-MACS (figura 1). Se não estiver disponível imediatamente um citómetro de fluxo, conservar a alíquota a 4 °C até à análise.
   15. Congele os EPCs CD31+ neste ponto.
       nota: Placas de 12 poços revestidas com vitronectina e o meio de manutenção hiPSC mais estável (mTeSR plus) podem ser usados no lugar de placas revestidas com matriz de membrana basal e meio de manutenção hiPSC (mTeSR1). Para preparar placas de 12 poços revestidas com vitronectina, dilua a vitronectina com tampão de diluição até uma concentração final de 10 μg / mL e, em seguida, transfira 500 μL da solução diluída para cada poço das placas de 12 poços. Deixe as placas a 20-25 °C por pelo menos 1 h. A densidade de semeadura de hiPSCs singularizados é comparável à usada para placas revestidas com matriz de membrana basal. A alteração do meio de cultura ou da composição da matriz pode afetar a proliferação e a diferenciação espontânea de hiPSCs, que normalmente requerem 1-2 semanas para se adaptar a novas condições de cultura. Se o meio de manutenção hiPSC mais estável for usado para manutenção hiPSC, este meio pode ser usado para diferenciação EPC em vez do meio de manutenção hiPSC. Nesse caso, o meio de manutenção hiPSC mais estável deve ser trocado no Dia -2 para remover o inibidor de ROCK, e a troca no Dia -1 pode ser ignorada.

Resultados

Tabela 1: Detalhes dos reagentes específicos para os ensaios. O nome e a quantidade exata de ingredientes para cada reagente específico são descritos.

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Reagente específico	ingrediente	volume
Ácido acético, solução de 0,5 mg/ml	ácido acético

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,22 mm Filtro de seringa	TPP	Rolamento 99722
Tubo de centrífuga de 15 mL	falcão	352196
Filtro de células Falcon de 40 μm	falcão	Rolamento 352340
5 mL Tubo de fundo redondo	Spl	Nº 40005
Tubo de centrífuga de 50 mL	falcão	Rolamento 352070
Placa de 96 poços, fundo redondo	Spl	Rolamento 34096
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-500ml
ácido acético	Sigma-Aldrich	695092
DMEM/F12 avançado	Tecnologias da Vida	Rolamento 12634
Microscópio de fluorescência tudo-em-um	Keyence	BZ-X810
Suplemento B-27 (503), sem soro	Thermo Fischer Scientific	17504044
Albumina sérica bovina (BSA), 7,5% em dPBS	Sigma-Aldrich	Rolamento A8412
Tampão de diluição CellAdhere	Tecnologias STEMCELL	ST-07183
CHIR99021	Produtos Químicos Selleck	S1263
Colágeno IV da placenta humana	Sigma-Aldrich	C5533
Placas de cultura de tecidos Corning (12 poços)	Corning	3512
Placas de cultura de tecidos Corning (6 poços)	Corning	3506
Tampa interna do tubo criogênico 2,0 mL	Watson	1396-201S
Dimetilsulfóxido (DMSO), estéril	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM (13), [+] 4,5 g/L de D-glicose, [-] L-glutamina, [-] piruvato	Thermo Fischer Scientific	31053-028
PBS de Dulbecco (d) (sem cálcio, magnésio)	Thermo Fisher	14190250
Meio de Eagle modificado de Dulbecco/mistura de nutrientes F-12 (DMEM-F12)	Thermo Fischer Scientific	11320074
Kit de Seleção Positiva EasySepFITC II	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 18558
Ímã EasySep	Tecnologias de células-tronco	18000
Solução de ácido etilenodiaminotetracético0,02% em DPBS	sigma	E8008-100ML
Soro fetal bovino, qualificado	Thermo Fischer Scientific	10270106
Solução tampão HEPES	Thermo Fischer Scientific	Rolamento 15630-056
Meio livre de soro endotelial humano (hESFM)	Thermo Fischer Scientific	11111-044
Fator de crescimento de fibroblastos humanos 2 (FGF2)	Tocris	233-FB-500
células-tronco pluripotentes induzidas por humanos iPS	Riken RBC	HPS1006
Sulfato de canamicina (100x)	Thermo Fischer Scientific	15160-047
Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnésio sal hidratado	Sigma-Aldrich	A8960-5G
L-Glutamina 200 mM (1003)	Thermo Fischer Scientific	Rolamento 25030-024
Matrigel, fator de crescimento reduzido	Corning	Rolamento 354230
MEM NEAA (1003)	Thermo Fischer Scientific	Rolamento 11140-035
Inibidor de ROCK Y-27632	Tocris	1254
RPMI médio 1640 Base Tris	Sigma-Aldrich	Rolamento 93362
Tritão X-100	Sigma-Aldrich	100 X