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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação do meio de armazenamento e recuperação de células-tronco
- Preparar o meio de cultura (DFHGPS) combinando os reagentes nas etapas 1.1.1.-1.1.5.
- Adicione 210 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium com alto teor de glicose e L-glutamina (D). Armazene-o a 4 °C.
- Adicione 70 mL da mistura de nutrientes F12 da Ham's com suplemento de L-glutamina (F). Armazene-o a 4 °C.
- Adicione 4,2 mL de tampão HEPES de 15 mM (H) e armazene-o em temperatura ambiente.
- Adicione 4,2 mL de solução de D-glicose a 10% (G) e armazene em temperatura ambiente.
- Adicione 2,88 mL de solução de penicilina/estreptomicina (PS). Aliquotar a solução estoque em alíquotas de 3 mL e armazená-las a -20 °C até que seja necessário.
nota: A concentração final de penicilina no meio será de 100 unidades/mL, e a concentração de estreptomicina será de 100 μg/mL. Este meio será referido como DFHGPS pelo restante do protocolo e deve ser armazenado a 4 °C para uso dentro de 1-2 semanas. Se necessário, o DFHGPS pode ser ampliado proporcionalmente.
- No dia anterior à recuperação das células, cubra um frasco T75 com 5 mL de meio condicionado obtido de culturas anteriores da linhagem hNSC e deixe-o em uma incubadora a 37 °C com 8,5% de dióxido de carbono (CO2) durante a noite.
nota: Se estiver cultivando hNSCs, salve o meio em que as células cresceram durante uma mudança de meio. Este é um meio condicionado, pois foi "condicionado" pelas células. O meio condicionado pode ser guardado em um tubo com tampa de rosca e armazenado a 4 °C por aproximadamente 7 dias. Entre em contato com o autor correspondente para receber hNSCs. O meio condicionado é preferido, mas não absolutamente necessário, principalmente ao iniciar a cultura de hNSCs.
- No dia da recuperação, aqueça 20 mL de DFHGPS em um tubo com tampa de rosca de 50 mL em banho-maria a 37 °C por pelo menos 10 min e mantenha-o em banho-maria até a hora de usar.
- Em um tubo de tampa de rosca separado de 15 mL, aqueça 10 mL de DFHGPS em banho-maria a 37 °C por pelo menos 10 min e mantenha-o em banho-maria até que esteja pronto para uso na etapa 1.13.
- Recupere um recipiente de gelo e todos os componentes do meio (Tabela 1). Descongele todos os componentes médios no gelo e deixe-os no gelo enquanto se prepara para a mudança do meio.
- Obter 5 ml de material de reserva de meio condicionado (conservado a 4 °C) e mantê-lo em banho-maria a 37 °C até estar pronto a utilizar no passo 1.14. Veja a nota após a etapa 1.2 se não houver meio condicionado ou cultura atual de células-tronco neurais fetais humanas.
- Recupere o tubo com tampa de rosca de 50 mL da etapa 1.3 e coloque-o no gabinete de biossegurança (BSC). Transfira 10 mL de DFHGPS para um novo tubo com tampa de rosca de 15 mL e, em seguida, coloque o tubo de 50 mL contendo os 10 mL restantes de meio DFHGPS de volta no banho-maria a 37 ° C.
- Obtenha um frasco criogênico de hNSCs armazenados em nitrogênio líquido. Consulte a nota após a etapa 1.2 se não houver cultura atual de células-tronco neurais fetais humanas.
nota: As células-tronco neurais humanas foram originalmente derivadas de cérebros fetais humanos descartados12 e mantidas em cultura sem modificações genéticas10. 5 × 106 células devem ser descongeladas e plaqueadas num balão T75. Cada frasco para injetáveis criogênicos deve conter 5 × 106 células; portanto, é necessário um frasco para injetáveis por frasco.
- Descongele um frasco de células em banho-maria a 37 °C, invertendo o frasco a cada 10 s por aproximadamente 1 min ou até que o gelo derreta e o conteúdo do frasco esteja completamente líquido. Não mergulhe todo o frasco para injetáveis na água para evitar uma potencial contaminação.
- No BSC, use uma micropipeta P1000 para aspirar a solução de células descongeladas e adicione-a gota a gota ao tubo de 15 mL da etapa 1.7, contendo 10 mL de DFHGPS. Para adicionar a solução celular descongelada gota a gota, pressione lentamente o êmbolo para que apenas uma ou duas gotas sejam liberadas de uma vez. Enquanto isso, gire o tubo de 15 mL para permitir uma mistura rápida.
- Centrifugue a suspensão da célula a 200 x g por 5 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante, certificando-se de reter o pellet celular.
- Durante a etapa 1.11, recupere o tubo de 50 mL contendo os 10 mL restantes da etapa 1.7. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet celular no DFHGPS de 10 mL e centrifugue novamente a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente.
- Durante a centrifugação final, prepare o novo meio de crescimento seguindo a Tabela 1 para adicionar fatores de crescimento aos 10 mL de meio DFHGPS da etapa 1.4 (Tabela 1) no BSC. Deixe o novo meio contendo fatores de crescimento no BSC até que esteja pronto para uso.
- Retirar o balão T75 do passo 1.2 e rejeitar o meio condicionado que reveste o balão por aspiração. Em seguida, adicione os 5 mL de meio condicionado da etapa 1.6. para o balão usando uma pipeta sorológica. Tenha cuidado para não arranhar o fundo do frasco.
- Retirar o tubo de células da centrífuga e rejeitar o sobrenadante aspirando-o, deixando o sedimento de células intacto.
- Ressuspenda o pellet celular em 10 mL de novo meio da etapa 1.13 usando uma pipeta sorológica de 5 mL e pipetando para cima e para baixo várias vezes. Adicionar a suspensão ao balão T75 revestido do passo 1.14. Use os 5 mL restantes para enxaguar o tubo que continha o pellet celular e, em seguida, adicione esses 5 mL ao frasco também.
- Balance o frasco T75 para frente e para trás 3 vezes para garantir que as células sejam distribuídas uniformemente pelo frasco. Certifique-se de que a tampa do frasco esteja solta para permitir o fluxo de ar. Sob um microscópio óptico, observe as células, faça anotações e tire imagens, se possível.
nota: As células devem parecer translúcidas e esféricas. Anote se há células que parecem escuras, opacas ou têm bordas assimétricas, pois isso pode indicar morte celular. Além disso, observe se há contaminação fúngica ou bacteriana, como a mídia ficando amarela.
- Colocar o balão de células numa incubadora a 37 °C com 8,5% de CO2.
nota: Use 8,5% em vez de 5,0% de CO2 para manter o pH deste meio de cultura sem soro na faixa de 7,1-7,4.
2. Alteração média do hNSC
NOTA: Mude o meio a cada 3-4 dias.
- Ligue o BSC e limpe bem com etanol 70%. Observe as células sob um microscópio óptico.
nota: Faça anotações sobre a aparência das células e tamanhos das esferas. Três dias após a recuperação ou passagem, as células se agrupam e começam a formar neuroesferas não aderentes.
cuidado: Se as células aderirem ao fundo do frasco, a cultura precisará ser descartada, pois a adesão celular aumentará a diferenciação prematura e as células serão incapazes de manter um estado-tronco. Se houver muitas células no frasco, as células podem formar grandes esferas (maiores que 2 mm de diâmetro), caso em que as células no centro da esfera começarão a se diferenciar devido à falta de acesso aos fatores de crescimento no meio. Se forem observadas esferas maiores que 1 mm de diâmetro, as células podem ser passadas (etapas 3.1-3.22).
- Siga as etapas 1.4 e 1.5 e prepare 10 mL de meio fresco (consulte a etapa 1.13).
- Incline o balão para o lado, deixando as esferas afundarem no fundo do balão.
- Remover 5 ml de meio condicionado da parte superior do meio combinado com uma pipeta serológica de 5 ml, tendo o cuidado de não aspirar quaisquer neuroesferas. Coloque os 5 mL de meio condicionado em um tubo limpo de 15 mL.
- Remova mais 5 mL de meio condicionado do frasco, novamente evitando cuidadosamente as esferas, e coloque os 5 mL no mesmo tubo de 15 mL.
- Adicione 10 mL de novos meios da etapa 2.2 aos 5 mL restantes de meios e células condicionados no frasco. Coloque o frasco plano e observe as células sob um microscópio óptico.
- Se parecer que as células foram aspiradas durante a coleta do meio condicionado, gire o meio condicionado a 100 x g por 5 min à temperatura ambiente. Ressuspenda todas as células que se acumulam no fundo em 1 mL do meio condicionado e, em seguida, adicione-as ao frasco de cultura.
- Armazene os 10 mL de mídia condicionada não utilizada das etapas 2.5/2.6 a 4 °C em um tubo com tampa de rosca de 15 mL.
- Repita as etapas 1.17/1.18.
3. Passagem hNSC
- Se expandir os NSCs para um novo frasco, certifique-se de que todos os novos frascos sejam revestidos como na etapa 1.2.
- Limpe o BSC como na etapa 2.1 e execute as etapas 1.4 e 1.5.
- Prepare o meio como na etapa 1.13. Cada balão T75 requer 10 mL de meio. Para vários frascos T75, multiplique 10 mL de meio pelo número de frascos.
- Prepare 1 ou 3 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (dPBS) e glicose e coloque em banho-maria a 37 ° C para aquecer por 10 min (para solução de tripsina) de acordo com os volumes da Tabela 2. Não adicione tripsina ou DNase neste momento. A DNase pode ser necessária para quebrar qualquer DNA liberado das células mortas devido à dissociação mecânica ou química das células.
NOTA: Para um frasco T75 passado após 9-10 dias de crescimento, haverá aproximadamente 30 × 106 células se 5 × 106 foram originalmente semeadas no frasco. Normalmente, 1 mL de solução de dPBS é usado para 10 × 106 células. Portanto, 3 mL de solução de dPBS são necessários para um frasco T75 passado após 9-10 dias.
- Coloque um pequeno barco de pesagem limpo e um hemocitômetro no capô. Limpe com etanol 70% e deixe secar ao ar livre no exaustor por aproximadamente 5 min.
nota: O barco de pesagem será utilizado nos passos 3.17.1.
- Recupere o frasco de células que serão passadas da incubadora e traga para o BSC. Incline o frasco suavemente, permitindo que as células afundem no fundo do meio agrupado. Há cerca de 15 mL de meio no frasco.
- Remova cerca de 10 mL de meio em porções de 5 mL (ou seja, 5 mL + 5 mL). Coloque esses 10 mL de mídia em um tubo limpo de 15 mL rotulado como "CM" para "meio condicionado". Tenha cuidado para não aspirar nenhuma das células depositadas nos 5 mL restantes de meio no frasco; essas células e 5 mL de meio serão submetidos à etapa 3.8.
- Pegue 3 mL de meio condicionado do tubo "CM" (da etapa 3.7) e coloque em um tubo de 15 mL rotulado como "solução inibidora de tripsina". Isso será usado na etapa 3.12. Após a remoção dos 3 mL, restam 7 mL de meio condicionado no tubo "CM". Deixe o tubo "CM" de lado até a etapa 3.9.
- Remova os 5 mL de meio e células restantes no frasco T75 e coloque em um tubo limpo de 15 mL rotulado como "Células".
- Pegue o tubo "CM" contendo 7 mL de meio condicionado (da etapa 3.7.1) e lave o fundo do frasco T75 duas vezes com porções de 3,5 mL de meio condicionado usando uma pipeta sorológica de 5 mL. Após cada enxágue, coloque as porções de 3,5 mL no tubo "Células". O objetivo desta etapa é remover todas as neuroesferas (células) do frasco T75.
- Centrifugue o tubo "Células" a 100 x g por 5 min em temperatura ambiente. Enquanto as células estão girando, obtenha a solução de dPBS / glicose do banho-maria a 37 ° C e adicione a quantidade apropriada de tripsina e DNase de acordo com a Tabela 2.
- Depois que o tubo "Células" parar de girar, remova todo o sobrenadante do meio condicionado e transfira para o tubo "CM".
- Pegue o tubo rotulado como "solução inibidora de tripsina" da etapa 3.7.1. e adicione o volume de inibidor de tripsina indicado na Tabela 3. Use o mesmo volume de solução inibidora de tripsina que foi usado para a solução de tripsina.
- Colocar a solução inibidora de tripsina no banho-maria a 37 °C até ser necessário.
- Adicione a solução de tripsina ao pellet celular no tubo de 15 mL e pipete para cima e para baixo aproximadamente 5-10 vezes com uma pipeta de 5 mL. Feche a tampa do tubo e incube em banho-maria a 37 °C por 5 min. Após 5 min, recupere as células e pipete para cima e para baixo 5 a 10 vezes. Em seguida, incubar em banho-maria a 37 °C por mais 10-15 min.
- Nos últimos 5 min, mova a solução inibidora de tripsina para o BSC.
- Recupere as células após a conclusão da etapa 2.14 e pipete as células para cima e para baixo até que as esferas estejam completamente dissociadas (20-30 vezes). Em seguida, adicione imediatamente a solução inibidora de tripsina e pipete para cima e para baixo 10 vezes. Esta solução de células dissociadas e inibidor de tripsina será referida como "suspensão celular".
- Conte o número de células na suspensão celular seguindo as etapas.
- Pipete 15 μL de pré-mistura de azul de tripano (contendo 5 μL de azul de tripano a 0,4% e 10 μL de dPBS) em um pequeno barco de pesagem e, em seguida, adicione 5 μL da suspensão celular. Pipete para cima e para baixo 3-5 vezes para misturar. Em seguida, pipete 10 μL da suspensão de Trypan Blue/célula em ambos os lados de um hemocitômetro coberto com uma lamínula de vidro.
- Observe as células sob um microscópio óptico e conte o número total de células em cada uma das quatro grades de canto. Some esses números.
- Repita a contagem para o outro lado e calcule a média dos dois lados juntos.
- Multiplique esse número por 10.000 para obter o número total de células por mL. Multiplique esse número pelo número total de mililitros para calcular o número total de células na suspensão celular. Calcule quanto volume de suspensão celular será necessário para semear 5 milhões de células por frasco T75.
nota: Normalmente, após 9 a 10 dias, um T75 terá 25 a 30 × 106 células. Portanto, se passar todas as células para novos frascos, é necessário um total de 5-6 frascos.
- Adicionar o volume de suspensão de células calculado no passo 3.19 a cada balão T75 para obter 5 × 106 células por balão. Se o volume for inferior a 5 mL, adicione meio de condição adicional para perfazer um total de 5 mL. Em seguida, adicione 10 mL de novo meio DFHGFPS contendo fatores de crescimento (Tabela 1) ao frasco.
- Repita as etapas 1.17 e 1.18 e certifique-se de que o frasco esteja rotulado com o tipo de células, as datas, o número de células no frasco e o número de passagem (este é o número de vezes que a célula foi passada). Em seguida, vá para a Etapa 4.
- Se necessário, semeie células extras em um frasco T75 a uma densidade de até 30 × 106 células por frasco durante a noite e congele no dia seguinte de acordo com a Etapa 4.
4. Congelamento e armazenamento do hNSC
- No dia seguinte à passagem, retirar o balão da incubadora que contém as células para congelação (das etapas 3.19 e 3.22). Inclinar o balão e retirar todo o meio e células do balão e colocá-lo num tubo de 15 ml. Em seguida, centrifugue o tubo a 216 x g por 5 min.
- Durante o processo de centrifugação, prepare o meio de congelação (Tabela 4). Para cada 5 × 106 células, prepare 1 mL de meio de congelamento. O número de células foi determinado na etapa 3.19 ao determinar quantas células colocar em cada frasco. Este número não terá mudado da noite para o dia.
- Prepare frascos de criopreservação com rótulos de nome de célula, número de passagem, número de célula, iniciais e data. Após centrifugação, remover o sobrenadante por aspiração e ressuspender o sedimento celular em meio de congelamento, de modo a que haja 5 × 106 células/ml. Usando uma pipeta de 5 mL, alíquota de 1 mL por frasco para injetáveis e feche bem (5 × 106 células por frasco para injetáveis).
- Coloque os frascos para injetáveis em um recipiente de criopreservação com 250 mL de isopropanol (o uso máximo é de 5 vezes por substituição de isopropanol). Conservar num congelador a -80 °C durante a noite e, em seguida, transferir para um sistema de armazenamento de azoto líquido.
5. HNSC aderente ao revestimento para validação
- No dia anterior à passagem (etapas 3.1-3.22), limpe o BSC como na etapa 2.2 e obtenha uma placa de 24 poços e lamínulas de vidro estéril de 12 mm.
- Usando uma pinça, coloque uma única lamínula no fundo de cada poço da placa.
- Cubra os alvéolos contendo lamínulas com 0,01% de poli-D-lisina (PDL) em água estéril e incube por 1 h a 37 °C. Para uma placa de 24 poços, use 250 μL de PDL por poço.
- Remova o PDL dos poços e, em seguida, cubra-o com 1 μg / cm2 de laminina / dPBS (250 μL por poço). Incubar a placa durante a noite a 37 °C. Se não for necessário no dia seguinte, feche a placa com parafilme envolvendo-o nas bordas da placa e armazene a 4 °C.
nota: As placas revestidas com laminina podem ser armazenadas por até 2 semanas se seladas com parafilme, desde que as lamínulas não sequem.
- Passe as células conforme descrito nas etapas 3.1-3.22 e, em seguida, determine o número de células a serem semeadas na placa de 24 poços com lamínulas revestidas.
- Remova qualquer excesso de solução de laminina dos poços por aspiração e enxágue uma vez com 0,5 mL de dPBS. Em seguida, semeie células nos poços a uma densidade de 0,6-1 x 105 células/cm2 por poço. Use as células restantes de acordo com as etapas 3.16 a 3.21.
- Em vários momentos durante a cultura em placas de 24 poços, fixe e core as células para vários marcadores de células-tronco.