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1. Geração de agregados iPSC
- Geração de culturas monocelulares monocelulares a partir de colônias iPSC
- Prepare uma placa de 6 poços revestida com extrato de membrana basal (BME). Descongele o BME no gelo a 4 ° C por 2-3 h, dilua-o com o meio Eagle modificado F12 de Dulbecco frio (DMEM-F12; diluição 1:50), cubra a placa com 1 mL / poço da solução diluída de BME e armazene a placa durante a noite a 4 ° C.
- Aspire o meio e lave as colônias iPSC intactas de pelo menos dois poços de uma placa de 6 poços com 0,5 mM de EDTA em solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes antes de incubar as colônias com 0,5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS por 4 min à temperatura ambiente (RT). Aspire a solução de EDTA e retire suavemente as colônias, lavando-as do fundo do prato com 5 mL de meio DMEM-F12. Colete-os em um tubo de 15 mL e pelete-os por centrifugação (4 min a 1.200 x g em RT).
NOTA: iPSCs reprogramadas a partir de fibroblastos disponíveis comercialmente foram usadas com sucesso.
- Aspirar o sobrenadante e incubar as colónias de iPSC com 500 μL de reagente de dissociação celular durante 6 min a 37 °C.
- Pipetar a suspensão celular várias vezes suavemente para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL para quebrar os aglomerados de células restantes em células únicas.
- Adicione 4 mL de DMEM-F12 à suspensão celular para diluir o reagente de dissociação celular.
- Gire as células para baixo a 1.200 x g por 4 min em RT.
- Ressuspenda as células em 2 mL de meio iPSC suplementado com 5 μM de Y-27632 e semeie as células em um poço de uma placa de 6 poços revestida com BME.
nota: Use o meio iPSC especificado na Tabela de Materiais para culturas iPSC monocamada de célula única.
- No dia seguinte, substitua o meio por um novo meio iPSC sem Y-27632. A partir deste ponto, continue a cultivar as células, mudando o meio todos os dias até que as iPSCs estejam 100% confluentes. Dependendo da linha celular e da confluência dos poços iniciais, isso levará de 2 a 4 dias.
- Uma vez confluentes, passe os iPSCs. Aspirar o meio e aplicar 500 μL de reagente de dissociação celular nas células.
- Incube as células por 5-10 min a 37 °C. Balance suavemente a placa para separar as células.
- Lave as células do poço usando 2 mL de DMEM-F12 e colete-as em um tubo de 15 mL. Adicione DMEM-F12 para um volume total de 5 mL.
- Gire as células a 1.200 x g por 4 min em RT e aspire o sobrenadante.
- Semeie as células em meio iPSC suplementado com 5 μM de Y-27632 em uma proporção de 1:2 a 1:4 em uma placa de 6 poços revestida com BME (2 mL/poço de meio).
- Continue a cultivar as células por 2-5 dias e troque o meio iPSC sem Y-27632 todos os dias. Uma vez confluentes, passagem de iPSCs (passos 1.1.4-1.1.8).
nota: Cultive as iPSCs por pelo menos 2 passagens como monocamada no meio iPSC especificado na Tabela de Materiais antes de usá-las para a geração de agregados iPSC para permitir que as células se adaptem às condições de cultura.
- Utilizar culturas iPSC monocamada quando estiverem 70-90% confluentes para a geração de agregados iPSC.
NOTA: As iPSC adaptaram-se às condições de cultura, uma vez que as células individuais são menos propensas ao stress que leva à morte celular durante o procedimento de dissociação e agregação. As culturas de iPSC em monocamada precisam exibir morfologia pluripotente típica sem evidência de diferenciação. Teste as culturas regularmente para contaminação por micoplasma. Trabalhe apenas com culturas de iPSC livres de micoplasma.
- Aspirar o meio de cultura de um poço de uma placa de 6 poços e aplicar 500 μL de reagente de dissociação celular nas células.
- Incube as células por 5-10 min a 37 °C. Balance suavemente a placa para separar as células.
- Lave as células do poço usando 2 mL de DMEM-F12 e colete-as em um tubo de 15 mL. Adicione DMEM-F12 para um volume total de 10 mL.
- Para a contagem de células, pegue 25 μL da suspensão celular e misture com 25 μL de azul de tripano para marcar as células mortas. Conte as células vivas usando uma câmara de contagem.
- Colete células suficientes (4.500 células por agregado iPSC) da suspensão celular em um tubo de 15 mL.
- Gire as células a 1.200 x g por 4 min em RT e aspire o sobrenadante.
- Ressuspenda as células em um volume apropriado de meio iPSC suplementado com 50 μM Y-27632 para obter 4.500 células vivas por 150 μL.
nota: O uso de uma alta concentração de Y-27632 (50 μM) é fundamental para a sobrevivência das iPSCs.
- Coloque 150 μL em cada poço de uma placa de fundo em U de 96 poços de baixa fixação e coloque-a na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
nota: Ao gerar agregados iPSC, considere que pelo menos 6 organoides são necessários para o controle de qualidade no dia 20 (consulte a Seção 5).
2. Indução do neuroectoderma anterior
- Monitore de perto as alterações morfológicas dos agregados iPSC todos os dias sob o microscópio de cultura de tecidos usando uma lente de potência 4X ou 10X. Observe no dia 1, agregados celulares com bordas claras. Continuar a cultivar agregados iPSC na incubadora a 37 °C e 5% de CO2,
nota: Um certo número de células mortas/poço é normal e não afetará a geração de organoides.
- Alimente os agregados iPSC a partir do dia 2 e continuando a cada dois dias, aspirando suavemente aproximadamente 2/3 do meio sem perturbar os agregados celulares na parte inferior. Adicione mais 100 μL de meio iPSC sem Y-27632.
nota: Dentro de 4-6 dias, os agregados celulares terão 350-450 μm de diâmetro e exibirão bordas lisas.
- Nesta fase, agrupe os agregados celulares com uma ponta de pipeta cortada de 100 μL em um prato de baixa fixação de 6 cm (máximo de 20 agregados/prato) em meio de indução cortical contendo DMEM-F12 com suplemento de N2 (1:200), suplemento de B27 (1:100), glicose (0,2 mg/mL), monofosfato de adenosina cíclico (cAMP; 0,15 μg/mL), 0,5% de aminoácidos não essenciais (NEAA), L-alanil-L-glutamina a 1%, heparina (10 μg/mL) e os compostos LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) e inibidor da resposta Wnt-1 (IWR-1) (10 μg/mL). Alimente os agregados celulares trocando o meio de indução cortical 3 dias após transferi-los para o prato de 6 cm.
- Monitore de perto as alterações morfológicas durante a indução cortical sob o microscópio de cultura de tecidos usando uma lente de potência 4X.
nota: Após 4-5 dias em meio de indução cortical, as bordas dos agregados celulares devem começar a clarear na superfície, indicando diferenciação neuroectodérmica. Nesta fase, surge a organização radial de um epitélio pseudoestratificado. Prossiga para a Seção 3 para incorporar os agregados de células em uma matriz BME.
3. Incorporação de agregados neuroectodérmicos em um andaime de matriz
- Descongelar o BME no gelo a 4 °C durante 2-3 h. Alíquota BME não diluída em quantidades suficientes.
- Prepare uma folha de filme plástico de parafina para o procedimento de incorporação. Corte o filme plástico de parafina usando uma tesoura estéril em pedaços grandes de 4 cm x 4 cm, coloque um pedaço do filme plástico de parafina sobre uma bandeja vazia de 100 μL para pontas de 100 μL e pressione com um dedo enluvado para que pequenas covinhas na folha de filme plástico de parafina sejam criadas (1 covinha / agregado celular necessário). Limpe o filme plástico de parafina com etanol a 70% e irradie-o com luz ultravioleta (potência: 15 watts, comprimento de onda: 435 nm) sob a bancada estéril fechada por 30 min.
- Transfira cada agregado celular para uma covinha da folha de filme plástico de parafina usando uma ponta de corte de 100 μL com abertura de 1,5-2 mm de diâmetro. No caso de dois agregados de células serem fundidos, não os separe, mas transfira-os juntos para uma covinha.
- Aspire suavemente o meio ao redor dos agregados celulares usando uma ponta de pipeta de 100 μL não cortada.
nota: Tenha cuidado para não sugar os agregados de células para a ponta, pois isso danificará os agregados.
- Adicionar 40 μL de BME não diluído a cada agregado celular.
- Posicione cada agregado de célula no meio da gota de BME usando uma ponta de pipeta de 100 μL sem cortes.
nota: Tenha muito cuidado para não prejudicar o neuroepitélio em desenvolvimento com a ponta da pipeta.
- Transfira cuidadosamente a folha de filme plástico de parafina usando uma pinça estéril para uma placa de Petri de 10 cm (ou outra placa de cultura de células suficiente) e coloque a placa na incubadora por 15-20 min para permitir que o BME solidifique.
- Enquanto isso, prepare um prato de baixa fixação de 6 cm contendo 5 mL de meio de indução cortical.
- Após a polimerização do BME, remova as gotículas contendo os agregados celulares da folha de filme plástico de parafina. Usando uma pinça estéril, vire o filme plástico de parafina e aperte suavemente os agregados celulares no prato de 6 cm de baixa fixação ligeiramente inclinado (cerca de 30 °) até que as gotículas caiam da folha de filme plástico de parafina. Transferir um máximo de 16 agregados celulares para uma placa de 6 cm.
- Continuar a incubar os agregados celulares a 37 °C.
4. Geração de Organoides do Tipo Prosencéfalo a partir de Agregados Neuroectodérmicos
- Um dia após a incorporação em uma matriz BME, coloque placas de cultura organoide em um agitador de cultura de células de balanço com ângulo de inclinação de 5 ° e 14 rpm, instalado em uma incubadora de cultura de células.
- Monitore organoides todos os dias. Estruturas homogêneas neuroepiteliais semelhantes a alças se desenvolvem gradualmente após a incorporação na matriz BME.
- Quando as estruturas da alça neuroepitelial estiverem visíveis, mude o meio para meio de diferenciação organoide contendo DMEM-F12 com suplemento de N2 (1:200), suplemento de B27 (1:100), glicose (0,2 mg/mL), cAMP (0,15 μg/mL), 0,5% NEAA, L-alanil-L-glutamina a 1%, insulina (2,5 μg/mL)
- Substitua o meio de diferenciação organoide a cada 3-4 dias até que o ponto de tempo de diferenciação desejado seja alcançado. Em seguida, corrija os organoides (consulte a Seção 5).
nota: Ocasionalmente, o tecido pode exibir brotos de tecido opticamente translúcido sem estruturas de alça. Embora isso não seja o ideal, isso não está afetando o desenvolvimento das estruturas corticais. Os organoides podem ser cultivados em meio de diferenciação organoide por até 40 dias. Por longos períodos de cultura (40-100 dias), o meio de diferenciação organoide pode ser suplementado com BME 1:50 para aumentar a complexidade do tecido e com BDNF e GDNF para permitir a sobrevivência e maturação neuronal.