Microfabricated Pós-Array-detectores (mPADs): uma abordagem para isolar Forças Mecânica

Resumo

Neste vídeo, demonstramos como fabricar e utilizar detectores microfabricated array post (mPADs) para avaliar as modulações da contratilidade celular.

Resumo

Neste vídeo, vamos apresentar nossa abordagem para medir forças de tração celular usando uma matriz microfabricated de posts. Forças de tração são geradas através de miosina-actina interações e desempenhar um papel importante em nossa fisiologia. Durante o desenvolvimento, elas permitem que as células a se deslocar de um local para outro a fim de formar as estruturas iniciais do tecido. Forças de tração ajudam nos processos de cura. Elas são necessárias para o fechamento adequado das feridas ou a migração de leucócitos e rastejando através do nosso corpo. Essas mesmas forças podem ser prejudiciais à nossa saúde no caso de metástase de câncer ou o crescimento vascular para um tumor. O método mais comum pelo qual o estudo de células in vitro tem sido a de usar um prato de vidro ou poliestireno. No entanto, a rigidez dos substratos torna impossível fisicamente medir forças de tração de células, e há relativamente poucos métodos para estudar as forças de tração. Nosso laboratório desenvolveu uma técnica para superar essas limitações. O método é baseado em um conjunto vertical de cantilevers flexível, a rigidez ea escala de tamanho das quais são tais que células individuais, distribuídos por cantilevers muitos e desviá-los no processo. Os pilares que usamos são 3 mm de diâmetro, 10 mM de altura, e são configurados em uma matriz regular com 9 mM espaçamento de centro a centro. Mas essas dimensões físicas podem ser facilmente variados para acomodar uma variedade de estudos. Começamos com um mestre de silício, mas as mensagens finais são feitas de borracha de silicone chamado poli (dimetil siloxano), ou PDMS. Podemos medir as deflexões sob um microscópio e calcular a magnitude ea direção das forças de tração necessária para produzir as deflexões observadas. Chamamos esses substratos microfabricated pós-array-detectores, ou mPADs. Aqui, vamos mostrar como podemos fabricar e usar o mPADs para avaliar modulações da contratilidade celular.

Protocolo

Fabricação de silicone Molde Mestre

Litografia

Materiais:

• 75 milímetros wafers de silício
• SU-8 2 Photoresist Negative (Microchem, Boston, MA)
• N2

Método:

1. Desidratar wafer Si a 120 ° C por 2 horas.
2. Superfície tratar UV do ozônio para a 7 minutos para remover compostos orgânicos.
3. N2 superfície golpe para remover partículas.
4. Aplicar SU-8 2 para cobrir 70% da superfície (~ 10 ml por 75 wafer mm).
5. Giram a 2000 rpm por 20 segundos com 300 rpm a aceleração / s.
6. Coloque o wafer numa placa de aquecimento e rampa de temperatura ambiente a 95 ° C.
7. Softbake o fotorresiste durante 15 minutos a 95 ° C.
8. Flood expor wafer de 20-25 mJ/cm2 dose em 365 nm (I-line) para formar a camada inferior.
9. Aplicar SU-8 2 para a camada de fotorresiste segundo.
10. Giram a 550 rpm por 20 segundos com 300 rpm a aceleração / s para um filme de espessura de aproximadamente 11 mM.
11. Coloque o wafer numa placa de aquecimento e rampa de temperatura ambiente a 65 ° C.
12. Softbake a hóstia a 65 ° C por 5 minutos.
13. Rampa a placa de aquecimento de 65 ° C a 95 ° C.
14. Softbake a bolacha durante 55 minutos a 95 ° C.
15. Wafer arrefecer à temperatura ambiente por 20 minutos.
16. Alinhe a máscara mPAD em wafer e expor para 95-100 mJ/cm2 dose em 365 nm (I-line).
17. Coloque o wafer numa placa de aquecimento e rampa de temperatura ambiente a 95 ° C.
18. Pós-exposição assar o fotorresiste durante 25 minutos a 95 ° C.

Desenvolver

Materiais:

• 100 milímetros pratos de vidro (5)
• Propilenoglicol acetato de éter metílico (PGMEA)
• Isopropanol (IPA)
• N2

Método:

1. Em um capuz químico, preencher cinco pratos com PGMEA (2), IPA, e hexano (2).
2. Segure wafer em 1 PGMEA por 10 segundos
3. Agitar wafer por 50 segundos
4. Transferência de wafer para PGMEA 2 com menisco de PGMEA.
5. Agitar durante 5 segundos.
6. Transferência de wafer de IPA com menisco de PGMEA.
7. Agitar por 20 segundos.
8. Transferência de wafer de 1 IPA.
9. Agitar durante 5 segundos.
10. Transferência de wafer para IPA 2.
11. Agitar durante 5 segundos.
12. Remover rapidamente wafer de IPA segundo com menisco do IPA e seque com N2
13. Inspecionar padrão.
14. Wafer Hardbake a 120 ° C por 14-20 horas para cross-link SU-8.
15. Dados da bolacha com um cortador de diamante
16. Monte o wafer sobre uma lâmina de vidro com epóxi
17. Fluorosilanize do wafer (ver instruções na moldagem de replicação)

Moldagem de replicação de mPADS

Molde negativo

Materiais:

• Descartáveis ​​de alumínio pesando barco
• Polidimetilsiloxano base (PDMS) e agente de cura (Dow, Midland, MI)
• Razorblade
• Silano: (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-triclorosilano
• Lâmina de vidro
• Pasteur Pipeta de vidro

Método:

1. Mix PDMS 10:01 em peso e em degas sob vácuo por 1 hora para remover as bolhas.
2. Coloque o molde mestre de silício em barco de alumínio.
3. Despeje 50-60 g de PDMS mais de mestre molde em barco de alumínio.
4. Degas, sob vácuo, durante 30 minutos para remover as bolhas.
5. Sopre bolhas de ar presas na superfície do PDMS com explosão rápida de N2.
6. Barco lugar em forno de convecção a 110 ° C por 15 minutos até PDMS é firme.
7. Cortar barco de alumínio.
8. Com lâmina de barbear, aparar silicone PDMS debaixo mestre.
9. Peel PDMS longe do mestre de silício lentamente e com movimento constante em uma direção para evitar a destruição do mestre.
10. Inspecionar mestre de silício para danos.
11. Cortar o molde negativo em 4 pedaços.
12. Repita os passos 1-10 para um lote grande de moldes negativos.
13. Plasma de oxigênio tratar molde negativo para 1,5 minutos para ativar superfície, ou
14. Ozônio tratar molde negativo por 10 minutos para ativar a superfície.
15. Lugar moldes negativos em exsicador com características mPAD expostos.
16. Spread 250-500 mL de silano sobre lâmina de vidro no centro da exsicador
17. Lugar pipeta de vidro com pastagens 150-200 mL de silano na ponta dentro exsicador.
18. Câmara de vácuo para evaporar silano e casaco moldes negativo para> 14 horas.

mPADS

Materiais:

• Polidimetilsiloxano base (PDMS) e agente de cura (Dow, Midland, MI)
• Boca larga descartáveis ​​pipetas de transferência
• 2 "x 3" slides de vidro
• Scribe vidro
• N2

Método:

1. Mix PDMS 10:01 em peso e em degas sob vácuo por 1 hora para remover as bolhas.
2. rendas silanizadas moldes negativos em 'cruz'
3. Pipeta PDMS em moldes negativos de modo que as características são totalmente cobertos com uma espessura de 1 mm.
4. Aguarde 30 minutos para as bolhas de ar no PDMS para subir à superfície.
5. Em 30 'tempo de inatividade, poeira 22x22mm (No. 2) lamínulas de vidro com uma corrente de N2.
6. Oxigênio plasma lâminas de vidro tratar metades de 1,5 minutos para limpar e ativar vidro
7. Sopre bolhas de ar presas na superfície do PDMS com explosão rápida de N2.
8. Cuidadosamente, coloque borda de vidro lamela em PDMS com plasma lado limpo de frente para o PDMS. Lentamente abaixe a lâmina de vidro para que o PDMS contatos totalmente a superfície do vidro inteiro e evitar bolhas de ar ficar preso debaixo da lâmina de vidro.
9. Lugar montados moldes em forno de convecção a 110 ° C por 20 horas para curar completamente.
10. Remover moldes do forno e deixe esfriar para RT.
11. Segure lâmina de vidro com uma mão em cima e lentamente casca negativos longe o molde negativo da parte inferior para liberar o mPAD.
12. Inspecionar o mPAD sob um microscópio para posts em colapso.
13. Re-silanizadas molde através de plasma e de silano a cada quatro peças fundidas. A vida útil do molde negativo para replicação boa é de aproximadamente 60-20 casts.

Células semeadura em mPADS

Estampagem

Materiais:

• PDMS selos para UCP (ver Tien, J & Chen, CS, em Métodos de Engenharia de Tecidos, 2001, pp 113-120).
• Etanol (100% e 70%)
• Água deionizada esterilizada
• 50 ug / ml fibronectina Humanos em água deionizada estéril (BD Biosciences)
• 5 ug / ml Solução DII filtrada com membrana de 0,2 mM (D-3886, Molecular Probes, OR)
• 2% Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, NJ)
• 1X solução tampão fosfato.
• 100 mm x 25 milímetros placa de Petri (4)
• 150 milímetros x 25 mm placa de Petri (2)
• Folha de alumínio
• N2
• Pinça
• Capa estéril

Método:

1. Apare o excesso de PDMS mPADs
2. Se o carimbo de PDMS tem sido utilizado anteriormente, sonicate selos em etanol 100% por 5 minutos para esfregar proteínas contaminantes.
3. Na capa estéril, segure selos em seus lados, com uma pinça e seco com N2 após imersão selos em etanol 100% frescos e água estéril
4. Lugar em 150 mm com placa de Petri trabalhando lado para cima.
5. Alíquota gotas de solução de fibronectina em cada selo. Comece com os cantos em cada um dos selos, em seguida, as bordas e, finalmente, as regiões do interior. Inicialmente a superfície do PDMS do selo é hidrofóbico, mas torna-se hidrofílico como a proteína é adsorvida. De trabalho "fora para dentro" muda o ângulo de contato do PDMS para que um menor volume de solução de fibronectina é necessário para cobrir a marca totalmente.
6. Deixe descansar por 1 hora na capa para adsorção de proteínas.
7. Lavar com água DI selos derramando no prato e deixar o nível da água aumentar ao longo dos selos.
8. Lavar selos em 100 milímetros placa de Petri com água DI.
9. Retire e seque com N2.
10. MPADS tratar de ozônio por 7 minutos para ativar a superfície de estampagem.
11. Sob o capô, carimbo mPADS colocando borda selo sobre mPAD e delicadamente abaixar para fazer contato. Toque levemente a parte superior do selo, com uma pinça para garantir todas as áreas têm um bom contato, mas tenha cuidado para não recolher a mensagens.
12. Remova cuidadosamente os selos com uma pinça.
13. MPADS submergir em 100 mm com placa de Petri de etanol 100% para ~ 15 segundos. Mantenha microagulhas de retração durante a transferência, transferindo rapidamente entre pratos.
14. MPADS submergir em 100 milímetros prato de Petri com álcool 70% para ~ 15 segundos.
15. MPADS submergir em 100 milímetros petri prato com água DI para ~ 15 segundos.
16. MPADS submergir na segunda placa de Petri com 100 milímetros de água DI para ~ 15 segundos.
17. MPADS submergir em 150 milímetros placa de Petri com água DI.
18. MPADS submergir em 150 milímetros placa de Petri com 100 mL de solução de DII.
19. Cubra com papel alumínio e deixe de molho por uma hora.
20. MPADS submergir em 100 milímetros petri prato com água DI para ~ 15 segundos.
21. MPADS submergir em 150 milímetros placa de Petri com 10 mL de Pluronics 2% e 90 mL de PBS para a concentração total de Pluronics 0,2%.
22. Cubra e deixe de molho por uma hora.
23. MPADS submergir em 100 milímetros petri prato com água DI para ~ 15 segundos.
24. MPADS submergir na segunda placa de Petri com 100 milímetros de água DI para ~ 15 segundos.
25. MPADS submergir na terceira placa de petri 100 mm com PBS para ~ 15 segundos.

Semeadura

Materiais:

• Linha celular escolhido
• Tripsina-EDTA (0,25% de tripsina com EDTA • 4NA, Cat Gibco. No. 25200-056)
• Meio de Crescimento
• 1X solução tampão fosfato.

Método:

1. Na capa estéril, mPADS lugar em 100 milímetros petri prato e preencha com 17 ml de meio.
2. Prato de Petri lugar na incubadora para aquecer a 37 ° C
3. Suspender as células através de tripsina
4. Aspirar várias vezes para quebrar agregados de células.
5. Pipeta suspensão celular para a placa de Petri com o mPADS. Adicionar tais células eles permanecerão células isoladas (sem contatos célula-célula) no momento da análise. A quantidade exata de células para adicionar é tipo celular específico edepende da área de células se espalhar e taxa de crescimento.
6. Suavemente dispersar células em placa de petri com pippetting lento.
7. Lugar na incubadora por 2 horas para permitir que as células se estabelecer e aderir em microagulhas.
8. Inspecionar mPADS para ver se as células se espalharam. As células vão olhar achatada e extensão de seis ou mais mensagens.
9. Se as células se espalham, a transferência para novas mPADS 100 milímetros placa de Petri com 21 mL de meio fresco.
10. O mPADS estão prontos para a experiência.

Coloração e montagem mPADS

Fixação

Materiais:

• Água deionizada
• Paraformeldahyde frasco (16%)
• Solução Tampão Fosfato 10X.
• 1X solução tampão fosfato.

Método:

1. Em um tubo de centrífuga 50 mL, adicionar 30 mL de DI, 10 mL de paraformeldahyde (frasco inteiro), e 4,5 mL de PBS 10X para a solução de fixação.
2. Adicionar ~ 25 mL de solução fixadora para um prato de 100 milímetros de petri.
3. Delicadamente mergulhe mPAD com células para fixação prato e deixe incubar por 20 minutos.
4. MPADS submergir em 100 mm com prato 1X PBS três vezes.
5. Pronto para imunocoloração e montagem.

Analisando Forças Celular em mPADS

Imagem confocal

Materiais:

• Microscópio confocal
• Objetivo 63X
• Cubos de filtros de anticorpos secundários
• Filtro verde cubo (rodamina) para DII imagem de microagulhas.

Método:

1. MPADs lugar no palco e encontrar uma única célula com 300 ms de exposição, não binning.
2. Tops imagem de microagulhas para IMAGEM TOP.
3. Usando z-controle de leitura, captura de imagem de microagulhas para a imagem de fundo.
4. Qualquer imagem de outros canais que você tem manchas na (Hoechst, phalloidin etc)

Análise de Imagem

Materiais:

• MATLAB com Image Processing Toolbox

Método:

1. Girar e registrar imagens superiores e inferiores
2. Centróides medida de fundo (undeflected) e superior (desviado) posições
3. Calcular o deslocamento
4. Usando a constante da mola para os cargos (conhecido, depende da geometria post), calcular vetor de força em cada posto
5. Análise de erros é baseada na capacidade de resolver as forças, e depende da resolução de imagem e resolução de detecção de centróide
6. Organizar os dados de acordo com suas necessidades personalizadas - por exemplo, magnitudes, força e / ou direção, como um curso de tempo, muitas medidas em condições diferentes, etc