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1. Preparação de materiais necessários para cultura de iPSC e diferenciação de BEC.
- Revestimento matricial de plástico de cultura de tecidos (TC) para cultura IMR90-4 iPSC
- Alíquota gel de matriz de membrana basal (por exemplo, Matrigel) em alíquotas de 2,5 mg e armazenar a -20 °C.
nota: Trabalhe rapidamente ao manusear o gel da matriz e a alíquota no gelo, pois forma um gel acima de 4 °C e não pode ser aliquotado depois de solidificado.
- Para revestir o plástico TC, adicione rapidamente uma alíquota de gel de matriz a 30 mL de meio Eagle Modificado (DMEM)/F12 de Dulbecco em um tubo cônico de 50 mL. Adicione 1 ml do meio ao gel de matriz congelada, pipete para cima e para baixo até descongelar e transfira imediatamente para o tubo cónico de 50 ml com o meio restante.
- Utilizar 1 ml desta solução de gel-revestimento de matriz por alvéolo de uma placa de 6 poços e 12 ml por balão T75.
nota: O plástico TC revestido com gel de matriz pode ser preparado até duas semanas antes de ser usado. No entanto, é fundamental evitar que a solução de gel da matriz seque, o que pode exigir a adição ocasional de mais DMEM/F12 no topo dos poços.
- Prepare o meio de manutenção de células-tronco adicionando 50 mL de suplemento 50x a 450 mL de meio basal de manutenção de células-tronco no ambiente estéril de um gabinete de biossegurança.
- Para preparar 500 mL de meio não condicionado (UM), combine 392,5 mL de DMEM/F12 com 100 mL de reposição de soro knock out (KOSR), 5 mL de aminoácidos não essenciais, L-glutamina na concentração final de 1 mM e 3,5 μL de β-mercaptoetanol. Filtre-esterilize e armazene a 4 °C por até 2 semanas.
- Para preparar 200 mL de meio de células endoteliais (CE) mais ácido retinóico (AR) mais bFGF, combine 198 mL de meio livre de soro endotelial humano (hESFM), 2 mL de soro derivado pobre em plaquetas esterilizado por filtro (PDS) e 20 ng/mL de bFGF. Filtre, esterilize e armazene por até 2 semanas a 4 °C. Pouco antes da adição às células, adicione 10 μM de RA ao meio EC.
nota: Como o PDS foi descontinuado e, portanto, pode ser limitado, este protocolo foi conduzido com sucesso usando B27 no lugar do PDS.
- Para preparar 200 mL de meio EC sem RA ou bFGF, combine 198 mL de hESFM e 2 mL de PDS esterilizado por filtro e esterilize por filtro. Conservar até 4 semanas a 4 °C.
2. Diferenciação de células endoteliais cerebrais de iPSCs humanas
- Plaqueamento de iPSCs para diferenciação (dia -3 do protocolo de diferenciação)
- De acordo com o poço de cultura de manutenção IMR90-4 usado para placa para diferenciação, aspire o meio de cultura, adicione 1 mL de reagente de dissociação celular enzimática por poço e incube a 37 ° C por 7 min.
- Inative o reagente enzimático de dissociação celular transferindo 1 mL de suspensão celular dissociada para um tubo cônico de 15 mL com pelo menos 2 mL de meio de manutenção de células-tronco frescas por 1 mL de células. Gire para baixo a suspensão celular a 1.500 x g por 5 min.
- Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio de manutenção de células-tronco por poço de células IMR90-4 usadas e conte as células usando um hemocitômetro.
nota: Pode ser útil diluir 1:1 com azul de tripano a 0,4% para distinguir entre células vivas e mortas durante a contagem. Dependendo da densidade dos iPSCs, um poço de uma placa de 6 poços geralmente rende 1\u20122 x 106 células.
- Para a diferenciação num balão T75, adicionar 7,5 x 105 células a 12 ml de meio de manutenção de células estaminais e inibidor de ROCK (dicloridrato de Y27632) a uma concentração final de 10 μM. Aspirar a solução de gel-revestimento de matriz de um balão T75 e transferir a suspensão celular para o balão. Distribuir as células igualmente agitando o balão para a frente e para trás e da esquerda para a direita e incubar a 37 °C e 5% de CO2,
nota: É fundamental adicionar o inibidor de ROCK nesta etapa para aumentar a sobrevivência das células-tronco únicas dissociadas. As células devem ser distribuídas uniformemente pelo frasco e em singlets exibindo uma morfologia espalhada, semelhante ao mesenquimal, devido ao tratamento com inibidor de ROCK.
- No dia -2 e no dia -1, troque o meio por meio de manutenção de células-tronco frescas; 12 mL por T75.
- No dia 0, inicie a diferenciação mudando a mídia para UM; 12 mL por T75.
- Alterar UM diariamente (dia 1 – dia 5).
nota: As células normalmente atingem a confluência após 2 a 3 dias em UM, que pode ser observada a olho nu ou através de um microscópio de campo claro invertido. À medida que a diferenciação progride, os "tratos neurais" nestin+ tornam-se visíveis com as células PECAM-1+ entre elas.
- Expanda seletivamente a população de células endoteliais mudando para meio EC com 20 ng/mL de bFGF e 10 μM de ácido retinóico (RA) (dia 6) e incubando por dois dias. O meio EC com bFGF pode ser preparado até duas semanas antes. A AR é adicionada a partir de estoque congelado no dia do uso (por exemplo, 1 μL de estoque de AR de 10 mM por 1 mL de EC + bFGF).
nota: A diferenciação bem-sucedida também pode ser alcançada sem suplementação de AR nos dias 6 e 8. A omissão de AR, no entanto, produzirá BECs com TEER reduzido.
- Revestir placas de cultura de células e inserções de membrana (por exemplo, Transwell) com colágeno IV e fibronectina (dia 7), para purificação dos BECs e experimentos subsequentes.
- Para o revestimento de inserções de membrana, combine 4 partes de colágeno IV (1 mg/mL em 0,5 mg/mL de ácido acético), 1 parte de fibronectina (1 mg/mL) e 5 partes de água estéril para tecidos. A solução de MEC pode ser diluída 1:5 para revestir placas de cultura de células (ou seja, 4 partes de colágeno IV, 1 parte de fibronectina, 45 partes de água). Incubar com solução de revestimento a 37 °C durante a noite.
NOTA: As placas e inserções de membrana também podem ser revestidas por pelo menos 4 h antes da subcultura no mesmo dia da etapa de purificação.
- Purifique os BECs subcultivando as células diferenciadas em placas revestidas de colágeno IV e fibronectina ou inserções de membrana (dia 8).
- Aspirar o meio EC e adicionar o reagente enzimático de dissociação celular (12 ml por T75). Incubar a 37 °C até que 90% das células se tenham desprendido do frasco.
nota: A dissociação celular pode levar até 1 h.
- Durante o tempo de incubação, remova a solução de revestimento de colágeno IV/fibronectina das placas/inserções previamente preparadas e deixe-as secar em uma capa estéril. Demora aproximadamente 20 minutos para os insertos secarem.
- Uma vez que as células tenham se desprendido, lave-as do frasco com uma pipeta de 10 mL. Pipete para cima e para baixo para obter uma suspensão de célula única.
nota: A suspensão de célula única é importante para uma contagem confiável de células e para obter monocamadas sólidas.
- Diluir com pelo menos o mesmo volume de hESFM fresco em um tubo cônico de 50 mL e contar as células usando um hemocitômetro.
- Pulverize as células a 1.500 x g por 10 min.
- Ressuspenda as células no volume apropriado de EC + bFGF + RA recém-preparadas para obter uma suspensão de 2 x 106 células/mL para semeadura em inserções de membrana. Adicione 500 μL (1 x 106 células) na parte superior de um inserto de 12 poços e 1,5 mL de meio EC + bFGF + RA na parte inferior. Para semeadura em placas de 24 e 48 poços, dilua a suspensão celular 1:2 e adicione 500 μL (5 x 105 células) e 250 μL (2,5 x 105 células) por poço, respectivamente. Distribuir as células uniformemente pelo poço/inserção e incubar a 37 °C a 5% de CO2.
- Troque o meio nas placas/transpoços para EC sem bFGF ou RA (dia 9).