Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Isolamento da fração vascular estromal (SVF)
Colete o tecido adiposo do arco periaórtico (PAAT) de 5-6 camundongos em um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo 1 mL de meio de digestão recém-preparado e pique o tecido usando uma tesoura cirúrgica em um tubo Eppendorf à temperatura ambiente (RT).
- Transfira a mistura para tubos de 50 mL contendo 9 mL do meio de digestão. Homogeneizar os tecidos pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL 10x.
- Incube os tubos a 37 °C com agitação constante a 100 rpm por 30 a 45 minutos e verifique a cada 5 a 10 minutos para evitar a digestão excessiva. Isso é fundamental para melhorar a viabilidade e o rendimento celular.
nota: Uma boa digestão do tecido resultará em um tecido adiposo homogêneo amarelo claro que é visível a olho nu ao girar suavemente o tubo.
- Pare a digestão adicionando 5 mL de HDMEM contendo 10% de FBS e 1% v / v PS em RT e misture bem pipetando.
- Centrifugar a suspensão da célula a 500 x g durante 5 min a RT. O SVF será visível como uma pelota acastanhada. Aspirar cuidadosamente os adipócitos flutuantes e decantar o sobrenadante restante sem perturbar o SVF. Dissolver o sedimento SVF em 10 ml de meio de cultura e filtrar através de um filtro de células de 70 μm.
- Centrifugue a suspensão celular a 500 x g por 5 min, remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet em 5 mL de tampão de lise eritrocitária em um tubo cônico de 15 mL por 10 min em RT.
- Pare a reação adicionando 10 mL de 1x PBS contendo 1% de FBS. Centrifugue a suspensão celular a 500 x g por 5 min a 4 ° C, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mL de 1x PBS contendo 1% de FBS.
- Centrifugue as células novamente a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de meio de cultura num tubo cónico de 15 ml a 4 °C.
- Após uma rodada final de centrifugação (500 x g por 5 min a 4 ° C), ressuspenda as células peletizadas em 5 mL de tampão FACS (PBS contendo 10% de FBS, 100 unidades / mL DNA I e 1% v / v PS) em gelo e conte as células com um hemocitômetro.
2. Isolamento de NCADSCs por FACS
- Configure e otimize o classificador de células seguindo o manual de instruções. Selecione o bico de 100 μm, esterilize os tubos de coleta, instale o dispositivo de coleta necessário e configure os fluxos laterais.
- Para classificar células RFP+, recomenda-se um laser amarelo/verde de 561 nm e um filtro óptico 579/16. Efectuar a compensação utilizando o controlo negativo e os controlos positivos de coloração simples. Consulte a Figura 1A para o esquema de gating.
- Filtre as células através de um filtro de 40 μm, centrifugue a 500 x g por 5 min e ressuspenda-as em 2 mL de tampão FACS a uma densidade de 0,5–1 x 107/mL. Transfira as células para tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL claramente rotulados e carregue-os no classificador.
- Execute o tubo de amostra experimental a 4 °C, ligue as placas de deflexão e classifique em um tubo cônico de 15 mL pré-revestido com RPMI contendo 1% de FBS e 1% v/v PS.
nota: Proteja as amostras da luz forte para minimizar a extinção da RFP.
3. Cultura dos NCADSCs
- Plaquear as células classificadas a uma densidade de 5.000 células/cm2 em uma placa de cultura de 12 poços em meio de cultura completo e incubar a 37 °C em atmosfera úmida com 5% de CO2 por 20–24 h.
- Remova o meio de cultura, lave as células com PBS pré-aquecido (37 ° C) para remover os detritos celulares e adicione meio de cultura fresco.
