Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação de soluções estéreis de poli-D-lisina (PDL) e laminina
- Pelo menos um dia antes do isolamento celular, prepare placas revestidas de poli-D-lisina (PDL) e laminina.
nota: Placas de 6 e 12 poços foram preparadas dependendo dos objetivos experimentais. Normalmente, placas de 12 poços foram usadas para a análise quantitativa usando western blots, enquanto placas de 6 poços foram usadas para conter lamínulas autoclavadas (estéreis) para imuno-histoquímica. Placas de 24 poços foram usadas para cultivar células gliais entéricas (EGCs) para imagens de fluxo de Ca2+.
- Dilua as soluções de estoque com água ultrapura de grau de cultura de tecidos, sem DNase e sem RNase em uma capela de cultura de tecidos com ar filtrado por HEPA.
- Esterilização de lamínulas de vidro
- Segure a lamínula com uma pinça estéril e mergulhe as lamínulas num copo de etanol a 100% durante 15 min. Deixe o etanol evaporar na capa de cultura de tecidos e coloque-o nas placas de 6 poços.
- Em alternativa, coloque várias lamínulas individualmente em papel mata-borrão de 2 mm de espessura num recipiente de plástico e depois autoclave.
2. Placas de revestimento
NOTA: Execute estas etapas sob uma capela de fluxo laminar de cultura de tecidos estéril.
- Descongele o estoque de PDL 1 mg / mL e dilua 1:10 com água estéril de grau de cultura de tecidos para que a concentração final seja de 100 μg / mL. Use 2 mL por poço para revestir placas de 6 poços, 1 mL para cobrir um poço de uma placa de 12 poços e 0,5 mL para um poço nas placas de 24 poços. Conservar o PDL diluído restante em alíquotas de 12 ml a -20 °C.
- Depois de permitir que o PDL cubra os poços por pelo menos 1 h, remova o PDL com uma pipeta estéril. Deixe as placas secarem completamente ao ar sob uma capela de fluxo laminar de cultura de tecidos.
nota: Depois de remover a solução de PDL com uma pipeta estéril, ela pode ser usada mais duas vezes dentro de 1 semana após passar por um filtro de 0,22 μm e armazenar a 4 °C.
- Descongele o caldo de laminina no gelo para evitar a formação de gel.
nota: A laminina não diluída torna-se sólida quando aquecida acima de 8 °C.
- Dilua o estoque de laminina (0,5 mg / mL) 1:50 com solução salina tamponada com fosfato estéril de Dulbecco (DPBS) para obter uma concentração final de 10 μg / mL. Conservar a laminina diluída em alíquotas de 12 ml a -20 °C.
- Adicionar laminina diluída aos alvéolos que contenham PDL seco. Use 1 mL para cobrir a superfície de 6 poços e 0,5 mL para cobrir o fundo das placas de 12 poços. Para lamínulas, adicione 400 μL de laminina diluída às lamínulas para obter cobertura da superfície.
- Incubar as placas revestidas a 37 °C durante 2 h, se a placa for utilizada no mesmo dia (revestimento rápido). Caso contrário, feche as placas com filme plástico e guarde-as durante a noite a 4 °C (revestimento lento).
nota: A vedação é fundamental para evitar ressecamento e contaminação.
- Remova a solução de laminina cuidadosamente com uma pipeta para evitar arranhar a superfície. Lave suavemente os poços três vezes com DPBS estéril.
- Adicione meios de crescimento glial completos a cada poço e mantenha as placas a 37 °C até que esteja pronto para adicionar a suspensão EGC.
nota: As placas revestidas de poli-D lisina e laminina podem ser armazenadas por 3 dias a 4 °C. Cubra as placas com vários dias de antecedência e armazene a 4 °C; lave as placas com solução salina tamponada com fosfato estéril de Dulbecco (DPBS) três vezes. Adicione 2 mL de DPBS estéril a cada poço após a lavagem final. Fechar a placa com parafilme e conservar a 4 °C. É essencial garantir que a laminina não seque.
3. Preparação de soluções de isolamento
- Prepare a solução de dissociação EDTA/HEPES/DPBS. Para 500 mL da solução, use DPBS estéril (sem cálcio e magnésio) para fazer uma solução final de 10 mM HEPES e 5 mM de EDTA. A 490 mL de DPBS, adicione 5 mL de tampão HEPES 1 M e 5 mL de solução estoque de EDTA 0,5 M. Conservar a 4 °C até à utilização.
- Preparar os meios de ressuspensão das células gliais utilizando os reagentes indicados no quadro 1.
- Prepare os meios de crescimento glial usando os reagentes listados na Tabela 2.
nota: Os meios de crescimento glial contendo GDNF podem ser armazenados durante uma semana a 4 °C.
4. Remoção do segmento intestinal
NOTA: Os camundongos tiveram livre acesso a comida e água antes da eutanásia pelo método de gota de isoflurano e remoção de um órgão vital. Foram utilizados camundongos C57BL/6 com mais de 8 semanas de idade. Ambos os sexos foram utilizados sem diferenças perceptíveis no preparo.
- Eutanasiar o camundongo com uma overdose de isoflurano e colocá-lo em decúbito dorsal em uma bandeja de dissecação. Prenda as extremidades e esterilize o abdômen com etanol a 70%. Cubra a pele com uma pinça e abra o abdômen com uma tesoura.
- Levante o fígado e identifique o estômago/piloro distal. Em seguida, remova 7 cm do intestino proximal. Tenha cuidado para não rasgar o intestino.
- Segure o piloro com uma pinça enquanto corta o mesentério.
- Use uma dissecção romba com a parte de trás da tesoura para raspar o pâncreas aderente.
- Colocar o segmento intestinal em DPBS gelada sem Ca2+ ou Mg2+ (Figura 1A).
nota: Outros segmentos do intestino ou cólon também podem ser removidos usando a mesma técnica.
- Use uma seringa de 5 ou 10 mL presa a uma agulha cega de 20 G para lavar o conteúdo fecal com DPBS gelada (Figura 1B).
- Divida o intestino em segmentos de 3 cm para remover o músculo longitudinal. NOTA: Segmentos intestinais de até dois camundongos são usados por 30 mL da solução de isolamento HEPES / EDTA / DPBS.
- Quebre cerca de 4 cm para separar o bastão de madeira da ponta de algodão. Mergulhe o bastão de madeira em DPBS (Figura 1C).
- Deslize suavemente um dos segmentos intestinais no bastão molhado ( Figura 2A-C ).
- Remova o mesentério aderente que ainda está preso com pinça de ponta fina (Figura 2D).
- Use uma lâmina de barbear limpa ou bisturi para fazer dois cortes longitudinais ao longo do intestino onde o mesentério foi fixado (Figura 2E).
- Molhe a ponta de algodão com DPBS. Esfregue a ponta de algodão molhada longitudinalmente ao longo do músculo para soltar o músculo longitudinal / plexo mioentérico (LMMP). Em seguida, mova a ponta de algodão horizontalmente para afastar o LMMP do músculo circular ao longo do comprimento do segmento intestinal durante a remoção do LMMP.
- Segure a ponta do bastão entre o polegar e o indicador enquanto estabiliza o segmento com o dedo médio e o quarto (Figura 2F). Quando concluído, o LMMP irá descascar facilmente o segmento intestinal.
- Descarte o LMMP retirado do tubo intestinal e conectado ao cotonete, a menos que a coleta de EGCs do plexo mioentérico seja desejada.
- Use uma lâmina de barbear para abrir o segmento intestinal longitudinalmente para removê-lo da vara de madeira.
- Armazene o tecido intestinal despojado (predominantemente mucosa e submucosa mais músculo circular) na SPBD no gelo. Repita as etapas 4.4–4.11 até que todos os segmentos intestinais estejam preparados.
5. Remoção da mucosa epitelial
- Corte os intestinos em pedaços menores de ~0,5 cm com uma tesoura fina.
- Coloque o tecido em um tubo de centrífuga cônico estéril de 50 mL contendo 30 mL de solução gelada de EDTA / HEPES / DPBS.
- Agite a solução contendo tecido a 4 ° C por 10 min a ~ 60 inclinações por min.
- Umedeça previamente uma pipeta de plástico de 5 mL pipetando o tampão EDTA/HEPES/DPBS para cima e para baixo uma vez e, em seguida, use a pipeta pré-umedecida para pipetar o tecido e a suspensão tampão para cima e para baixo (trituração) 20 vezes para desalojar a mucosa epitelial.
- Coletar o tecido da incubação de EDTA despejando a mistura através de um filtro de células de nylon de 100 μm. Descarte o fluxo turvo e cheio de muco (Figura 3).
- Coloque o tecido retido no filtro em um novo tubo de centrífuga cônico de 50 mL contendo 30 mL de EDTA / HEPES / DPBS gelado usando uma pinça de ponta fina.
- Repita a incubação EDTA / HEPES / DPBS uma segunda vez, balançando o tecido a 4 ° C por 10 min a ~ 60 inclinações por minuto para remover a mucosa epitelial adicional.
- Umedeça previamente uma pipeta de 5 mL com o tampão e, em seguida, pipete a suspensão de tecido para cima e para baixo 20 vezes para desalojar as células mucosas.
nota: O tecido tenderá a grudar no interior da pipeta à medida que mais do epitélio é removido.
- Coletar o tecido após a segunda incubação, despejando a mistura através de um filtro de células de náilon de 100 μm e descartar o fluxo. O segundo fluxo deve ser visivelmente menos turvo do que o primeiro (Figura 3).
- Repita as incubações de EDTA de 10 minutos até que a solução esteja quase límpida (cerca de 3 a 4 incubações, dependendo da quantidade de tecido e da eficácia da trituração) (Figura 3).
6. Coleta de células gliais entéricas da lâmina própria e submucosa
- Transfira o tecido do filtro de náilon para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL contendo 5 mL da solução de recuperação celular disponível comercialmente e agite por 25 a 30 min a 4 ° C.
- Triturar suavemente 10x para dissociar as células gliais entéricas da lâmina própria.
- Filtrar através de um filtro de 40 μm e recolher o filtrado num tubo limpo de 50 ml.
- Enxágue o tecido no filtro de náilon com 1 mL de DPBS.
- Descarte o tecido e transfira ~ 5–6 mL de filtrado para um tubo de centrífuga cônico limpo de 15 mL.
- Girar o filtrado a 2.000 x g numa centrifugadora de balde oscilante durante 5 min a 4 °C.
- Ressuspenda o pellet contendo células gliais em pelo menos 1 mL de tampão de ressuspensão, pipetando suavemente o pellet para cima e para baixo com uma ponta de pipeta de 500 μL. Evite introduzir bubbles.
nota: Ajuste o volume de ressuspensão conforme necessário para o número de poços e placas. Por exemplo, 1,2 mL para uma placa de 6 poços, 2,4 mL para duas placas de 6 poços, 2,4 mL para uma placa de 12 poços.
- Pipetar 200 μL da suspensão celular em cada alvéolo de 6 poços ou 100 μL para placas revestidas com laminina PDL de 12 poços contendo meios de crescimento glial.
- Não mexa na loiça depois de adicionar as células às placas e colocá-las na incubadora a 37 °C para permitir a aderência do número máximo de células.
nota: Uma preparação saudável de células se fixará dentro de 6 a 8 h, mas espere pelo menos 24 h antes de trocar o meio, pipetando suavemente o meio junto com as células não aderentes.
- Use as células para experimentos 3 a 4 dias após serem colocadas em cultura (Figura 4).
Tabela 1. Composição dos meios de ressuspensão das células gliais.
| Componentes | Volume a adicionar | Concentração Final |
| DMEM/F12 | 44,5 mL | _ |
| Soro fetal bovino (FBS) | 5 ml | 10% de sucesso |
| Penicilina-estreptomicina | 500 μL | Caneta de 100 UI/ml |
| estreptomicina | | 100 μg/mL de estreptococos |
| Gentamicina (estoque de 50 mg/mL) | 20 μL | 20 μg/mL |
Tabela 2. Composição dos meios de crescimento de células gliais
| Componentes | Volume a adicionar | Concentração Final |
| DMEM/F12 | 44 mL | _ |
| Soro fetal bovino (FBS) | 5 ml | 10% de sucesso |
| Penicilina-estreptomicina (100x) | 500μL | 100 UI/mL (caneta) |
| 100 μg/mL (estreptococos) | | |
| Gentamicina (estoque de 50 mg/mL) | 20 μL | 20 μg/mL |
| GDNF (estoque de 10 μg/mL) | 50 μL | 10 ng/mL |
