Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Purificação de capilares cerebrais suínos
- Colete de 8 a 10 cérebros de porcos domésticos de 5 a 6 meses (por exemplo, de um matadouro próximo) e transporte-os em gelo para o laboratório. Recomendamos iniciar o seguinte procedimento de purificação dentro de 2-3 h após o término do animal.
- Coloque os cérebros em uma bancada de fluxo estéril e lave-os suavemente com 1 L de PBS em um copo colocado sobre gelo.
- Remova cuidadosamente as meninges de um cérebro de cada vez usando uma pinça de ponta fina e transfira os cérebros livres de meninges para outro béquer de 1 L com PBS colocado no gelo. Estender o tempo necessário pode complicar a remoção. O tempo aproximado usado para cada cérebro deve ser de 10 a 15 minutos.
- Usando um bisturi, raspe a substância cinzenta de um cérebro de cada vez e transfira o material isolado para placas de Petri (8,8 cm2) contendo 20 mL de Mistura de Nutrientes DMEM F-12 (DMEM / F-12) colocada no gelo. Isole o máximo de massa cinzenta possível sem retirar o material da substância branca. Para a fragmentação inicial, passe o material de substância cinzenta por uma seringa de 50 mL sem agulha. Continue para todos os cérebros e reúna o material de massa cinzenta coletado. Estender o tempo necessário pode complicar a remoção. O tempo aproximado usado para cada cérebro deve ser de 10 a 15 minutos.
- Transferir a substância cinzenta isolada para o tubo triturador de um homogeneizador de tecidos portátil na proporção de 50/50 com o meio DMEM/F-12. Homogeneizar o material fazendo 8 pinceladas para cima e para baixo com um pilão solto, seguidas de 8 pinceladas para cima e para baixo com um pilão apertado. Continue até que todo o material isolado tenha sido homogeneizado, depois transfira o homogeneizado para um frasco de 500 mL e dilua com DMEM/F-12 até aproximadamente 450 mL de volume total.
- Filtrar o homogeneizado utilizando um frasco de 500 ml com tampa azul com suporte de filtro e malha de filtro de 140 μm e isolar os capilares passando o tecido através do filtro. Use um filtro por 50 mL de homogenato e lave cada filtro com DMEM/F-12 em seguida.
- Coloque os filtros contendo capilares em placas de Petri com uma solução de digestão de tripsina / EDTA (2,5% de tripsina, 0,1 nM EDTA em PBS), colagenase CLS2 (2.000 U / mL) e DNase 1 (3.400 U / mL) em DMEM / F-12. Use 1 placa de Petri (8,8 cm2, solução de 20 mL) por 3 malhas de filtro.
- Coloque as placas de Petri a 37 °C por 1 h em um agitador orbital a 180 rpm ou mexa suavemente a cada 10 min. Após 1 h, lave os capilares dos filtros com suspensão da placa de Petri usando uma pipeta de 1 mL.
- Divida a suspensão dos 3 pratos em 2 tubos de 50 mL e interrompa a digestão adicionando 10 mL de DMEM/F-12 a cada tubo de 50 mL.
- Centrifugar as suspensões celulares a 250 x g, 4 °C durante 5 min. Aspirar os sobrenadantes e ressuspender cada pellet em 10 ml de DMEM/F-12. Adicione mais 20 mL de DMEM/F12 a cada tubo. Repita esta etapa da centrífuga duas vezes.
- Deixe os tubos esfriarem no gelo por 5 min e transfira as soluções para 2 novos tubos de 50 mL.
- Centrifugue as suspensões celulares a 250 x g, 4 ° C por 5 minutos e ressuspenda cada pellet em 8 - 10 mL (aproximadamente 1 mL / cérebro usado) de solução de congelamento consistindo de 10% de DMSO em FBS.
- Transfira a suspensão celular para criogeniais, usando 1 mL por criogenial. Em média, a purificação resulta em 1 frasco por cérebro usado, em média, fornecendo células endoteliais para 12-16 inserções. Coloque os frascos para injetáveis em uma caixa de congelamento a -80 °C por pelo menos 4 h até durante a noite. Em seguida, armazene os criogeniais em um tanque criogênico com nitrogênio líquido.
cuidado: O nitrogênio líquido tem temperaturas extremamente baixas. Por favor, use proteção adequada.