Um método para o isolamento de unidades neurovasculares do cérebro de ratos

Resumo

Fonte: Brzica, H., et al,. Um método simples e reprodutível para preparar amostras de membrana de microvasos cerebrais de ratos recém-isolados. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra o processo de isolamento de microvasos cerebrais de ratos sacrificados. Inclui a dissecção do cérebro, limpeza do tecido e digestão mecânica, seguida de centrifugação repetida para isolar a fração pura dos microvasos.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto. O fluxo processual para o protocolo é representado na Figura 1.

1. Configuração para o procedimento

1. Prepare o tampão de microvasos cerebrais (BMB). Comece pesando 54,66 g de D-manitol, 1,90 g de EGTA (ácido etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetracético) e 1,46 g de 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (ou seja, Tris) em um béquer limpo. Adicione 1,0 L de água deionizada. Misture os componentes do tampão BMB usando um agitador magnético. Uma vez que a solução tenha sido bem misturada, ajuste o pH para 7,4 usando HCl 1,0 M.
2. Prepare uma solução de dextrana a 26% (MW 75.000) (p / v) antes de anestesiar os animais. Siga os passos a seguir para preparar a solução de dextrana.
   nota: É extremamente importante preparar esta solução com antecedência, pois o dextrano pode levar aproximadamente 1,5-2 h para se dissolver em um tampão aquoso.
   1. Pesar o dextrano em pó (26 g por 100 ml de tampão) para um copo limpo.
   2. Meça o volume apropriado de BMB e distribua-o em um béquer separado e limpo.
   3. Despeje lentamente o BMB no copo contendo dextrana em pó. Durante o vazamento do BMB, misture manualmente o dextrano em pó usando uma vareta de vidro para agitar.
   4. Ajuste o pH para 7,4 com HCl 1,0 M imediatamente antes do uso.
      nota: Um isolamento típico de microvasos cerebrais de 12 ratos Sprague-Dawley individuais (machos ou fêmeas; 3 meses de idade; 200-250 g cada) requer 200 mL de solução de dextrano (ou seja, 52 g de dextrano em 200 mL de BMB).

2. Extração de tecido cerebral de ratos Sprague-Dawley

1. Após o tratamento experimental desejado, anestesiar ratos Sprague-Dawley com cetamina (50 mg/kg; 2,5 mL/kg i.p.) e xilazina (10 mg/mL; 2,5 mL/kg I,p.). Diluir cetamina e xilazina em solução salina a 0,9% até as concentrações finais de 20 mg/mL e 4,0 mg/mL, respectivamente. Eutanásia de animais por decapitação usando uma guilhotina afiada de acordo com as diretrizes do IACUC (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais). Use o mesmo procedimento para ratos Sprague-Dawley machos e fêmeas.
2. Ressecção a pele do crânio do rato fazendo um único corte transversal usando uma tesoura cirúrgica.
3. Usando rongeur, remova cuidadosamente a placa do crânio e exponha o cérebro.
4. Remova o cérebro usando uma espátula. Retire o cérebro e coloque o tecido cerebral isolado em um tubo cônico de 50 mL contendo 5 mL de BMB. Adicione 1,0 μL de coquetel de inibidores de protease por 1,0 mL de tampão BMB imediatamente antes do uso.

3. Processamento cerebral

1. Transfira o tecido cerebral do tubo cônico de 50 mL para uma placa de Petri limpa.
2. Usando uma pinça, role suavemente o cérebro em papel de filtro de 12,5 cm de diâmetro para remover as meninges externas, que estão frouxamente aderidas ao córtex cerebral. Pressione suavemente o tecido cerebral contra o papel de filtro e enrole o tecido novamente. Vire o papel de filtro com frequência durante esta etapa.
3. Separe o plexo coróide dos hemisférios cerebrais usando uma pinça.
   nota: O plexo coróide aparece como um tecido membranoso claro localizado na superfície dos ventrículos cerebrais.
4. Alise suavemente o tecido cerebral e remova as meninges e bulbos olfatórios restantes usando uma pinça.
5. Coloque o tecido cerebral cortical em uma argamassa de vidro gelada. Adicione 5,0 mL de coquetel de inibidores de protease contendo BMB à argamassa.
6. Usando um homogeneizador de potência aérea, homogeneizar o tecido cerebral usando 15 movimentos para cima e para baixo a 3.700 rpm. Realize a homogeneização usando um moedor de papel de almofariz e pilão de 10 mL. Entre a homogeneização de cada amostra individual, limpar o pilão com etanol 70%.
   nota: Os traços de homogeneização devem ser consistentes em termos de ritmo e magnitude.
7. Despeje o homogeneizado em tubos de centrífuga rotulados.

4. Etapas de centrifugação

1. Adicione 8,0 mL de solução de dextrano a 26% a cada tubo de centrífuga rotulado contendo homogeneizado cerebral.
2. Inverta o tubo duas vezes e, em seguida, vortex completamente a amostra. Conduza o vórtice de cada amostra usando vários ângulos para garantir uma mistura completa da solução homogeneizada do cérebro com a solução de dextrano a 26%.
3. Centrifugue amostras a 5.000 x g por 15 min a 4 °C.
   nota: Para algumas análises, é útil comparar microvasos cerebrais com parênquima cerebral. Caso seja necessária a avaliação da expressão proteica no parênquima cerebral, o sobrenadante desta etapa de centrifugação (ou seja, fração do parênquima cerebral) pode ser coletado e armazenado a -80 ° C para uso futuro.
4. Remova o sobrenadante usando um aspirador a vácuo e uma pipeta Pasteur de vidro.
   nota: Deve-se tomar cuidado para não perturbar o pellet. Caso contrário, a quantidade de microvasos cerebrais coletados será reduzida, o que diminuirá significativamente o rendimento de proteínas desse procedimento.
5. Ressuspenda o pellet em 5,0 mL de coquetel de inibidores de protease contendo BMB (ou seja, 1,0 μL de coquetel de inibidores de protease por 1,0 mL de tampão BMB). Vortex o pellet para garantir uma mistura completa.
6. Adicione 8,0 mL de dextrano a 26% a cada tubo de centrífuga e vórtice, conforme descrito nas etapas 4.1-4.2 deste protocolo.
7. Centrifugue amostras a 5.000 x g por 15 min a 4 °C.
8. Usando um frasco a vácuo e uma pipeta de vidro, aspire o sobrenadante e certifique-se de que o pellet contendo o microvaso cerebral não seja rompido.
   nota: O excesso de material que aderiu à parede do tubo não contém microvasos e deve ser cuidadosamente limpo e removido.
9. Repita as etapas 4.5 a 4.8 mais duas vezes.
10. Uma vez concluídas as 4 etapas de centrifugação do dextrano, adicione 5,0 mL de BMB a cada pellet e vórtice para ressuspender a amostra.
    nota: Após a conclusão da etapa 4.10, microvasos inteiros podem ser coletados para análise da localização da proteína. Isso pode ser feito pegando uma alíquota de 50 μL de pellet de microvaso ressuspenso e espalhando-a em uma lâmina de microscópio de vidro. Os microvasos são então fixados a 95 °C por 10 min em um bloco de aquecimento, seguido de fixação em etanol gelado por mais 10 min. As lâminas podem então ser armazenadas a 4 °C até serem necessárias para estudos de imagem.

Resultados

Figura 1: Esboço de procedimentos e protocolos para isolar microvasos cerebrais de ratos e preparar amostras de membrana

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coquetel de inibidores de protease	Sigma-Aldrich	#P8340	Componente do tampão de microvasos cerebrais
D-manitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Componente do tampão de microvasos cerebrais
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	Componente do tampão de microvasos cerebrais
Base Trizma	Sigma-Aldrich	#T1503	Componente do tampão de microvasos cerebrais
Dextrano (MW 75.000)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Dextrano usado em etapas de centrifugação para separar microvasos do parênquima cerebral
Cetamina	MWI Saúde Animal	#501072	Anestésico geral
xilazina	Fornecimento Médico Ocidental	#5530	Anestésico geral
Solução salina a 0,9%	Fornecimento Médico Ocidental	N/A	Diluente anestésico geral
Papel de filtro (12,5 cm de diâmetro)	VWR	#28320-100	Usado para remoção de meninges do tecido cerebral
Tubos de centrífuga	Sarstedt	#60.540.386	Tubos descartáveis usados para etapas de centrifugação de dextrano
Ensaio Pierce™ Coomassie Plus (Bradford)	ThermoFisher Scientific	#23236	Medição da concentração de proteínas em preparações de membranas
Homogeneizador de energia aérea Wheaton	DWK Ciências da Vida	#903475	Necessário para homogeneização de amostras
10.0ml almofariz de vidro e moedor de tecido pilão	DWK Ciências da Vida	#358039	Necessário para homogeneização de amostras
ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	#H1758	Necessário para ajuste de pH de tampões
Fórceps padrão	Ferramentas de Belas Ciências	#91100-12	Usado para dissecção de tecido cerebral
Rongeurs de Friedman-Pearson	Ferramentas de Belas Ciências	#16020-14	Usado para abrir o crânio para isolar o cérebro
Tubos de centrífuga cônicos de 50 ml	ThermoFisher Scientific	#352070	Usado para coleta de tecido cerebral após isolamento
Pipetas de vidro Pasteur	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Usado para aspiração de detritos celulares após spins de dextrana
Etanol anidro	Sigma-Aldrich	#459836	Usado para limpeza de moedor de tecidos; diluído a 70% com água destilada
cetamina
Balde de gelo