Gerando neurônios piramidais corticais a partir de células-tronco neurais humanas

Resumo

Fonte: Gouder, L., et al,. Quantificação tridimensional de espinhas dendríticas de neurônios piramidais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo descreve um método para preparar lamínulas de vidro revestidas com poliornitina e laminina para aumentar a adesão e o crescimento de células-tronco neurais. A técnica envolve incubações e lavagens sequenciais, facilitando a formação de uma matriz de suporte que promove o crescimento e a diferenciação das células neuronais, mimetizando estruturas encontradas nos neurônios.

Protocolo

1. Cultura Neuronal
   nota: A reprogramação de fibroblastos em células-tronco pluripotentes, o compromisso com a linhagem dorsal do telencéfalo, a derivação, amplificação e o armazenamento de progenitores corticais tardios (LCP) foram descritos em Boissart et al. A diferenciação neuronal de células semelhantes a LCP também foi realizada de acordo com Boissart et al com pequenas modificações. Outros procedimentos foram desenvolvidos para reprogramação direta de fibroblastos em células-tronco pluripotentes induzidas, seguidas de sua diferenciação em neurônios. Este protocolo foi mantido, pois permite a produção seletiva de neurônios glutamatérgicos piramidais.
   1. Trate as placas de cultura de 6 poços com lamínulas de vidro com poliornitina (diluída a 1/6 em DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco), concentração de estoque de 0,01%) O / N, seguida de três lavagens em DPBS. Em seguida, adicione laminina (concentração de estoque de 1 mg / ml, diluída 500 vezes em DPBS) por pelo menos 10 horas sob a capela de fluxo.
   2. Placa e expedição NSC a baixa densidade (50.000 células/^cm2) em placas de cultura de 6 poços com lamínulas de vidro em 3 ml de meio de cultura constituído por DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/F12 (500 ml), 2 frascos (5 ml cada) de suplemento de N2, 2 frascos para injetáveis (10 ml cada) de suplemento de B27, 10 ml de Pen-Estreptomicina (Penicilina = 10.000 unidades/ml e Estreptomicina = 10.000 unidades/ml), 1 ml de 2-mercaptoetanol (solução-mãe: 50 mM) e laminina (1/500), sem factores de crescimento. PASSO CRÍTICO: Execute esta etapa com cuidado, adicionando células com movimentos de rotação lenta para reduzir o agrupamento de células.
   3. Remova o meio de cultura. Adicionar meio N2B27 fresco contendo 2 μg/ml de solução fresca de laminina para manter o neurónio ligado às lamínulas de vidro e evitar a aglomeração. Troque o meio a cada 3 dias. Conservar um pouco do meio restante (200 μl) antes de adicionar meio fresco para evitar que a célula seque. Em alternativa, proceda rapidamente e altere o volume total (3 ml).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
PD-PBS (1X), sem Cálcio, Magnésio e Vermelho de Fenol	Gibco/ Tecnologias de Vida	14190169
Biorreagente de solução de poli-L-ornitina	Sigma Aldrich	Pág. 4957
Laminina de rato	Dutscher Dominique	354232
Suplemento N2	Gibco/ Tecnologias de Vida	17502048
Suplemento B-27 sem vit A (50X)	Gibco/ Tecnologias de Vida	12587010
DMEM/PORCA. MIX F-12 W/GLUT-I	Gibco/ Tecnologias de Vida	31331028
Neurobasal Med SFM	Gibco/ Tecnologias de Vida	21103049
2-mercaptoetanol	Gibco/ Tecnologias de Vida	Rolamento 31350-010
Caneta-Steptomicina	Gibco/ Tecnologias de Vida	15140-122
Tampa de lamínula 13 mm	VWR	Nº 631-0150
Prolongar Gold Antifade Reagent avec DAPI	Gibco/ Tecnologias de Vida	Pág. 36931
Tween(R) 20 Bioextra, Líquido Viscoso	Sigma Aldrich Chimie	Pág. 7949
Fibroblastos Humanos	Biorrepositório de linha celular Coriell	GM 4603 e GM 1869	Instituto Coriell de Pesquisa Médica, Camden, NJ, EUA
Incubadora de CO2
Placas de cultura de 6 poços
Piptette