Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação e remoção do cérebro do mouse para fatiar
- Prepare-se para a perfusão e incubação de fatias.
- Aproximadamente 30 minutos antes do corte, prepare a solução de corte com alto teor de sacarose e o líquido cefalorraquidiano artificial com baixo teor de cálcio (aCSF) para incubação do corte antes do registro ou imagem.
- Disponha todas as ferramentas necessárias (tesoura grande de ponta romba, tesoura de mola pequena, pinça anatômica, tesoura grande ou guilhotina, tesoura de íris, pinça de joalheiro, seringa de 10 ml com agulha de 27G x 1/2 polegada, pequeno pedaço de papel de filtro de 1 cm x 2 cm e uma pipeta Pasteur com ponta quebrada para transferência de fatias) para perfusão e fatiamento, e prepare a bandeja de perfusão.
- Montar câmara de incubação com aCSF oxigenado em banho-maria a 32 oC e uma placa de cultura cheia de solução cortante.
- Prepare o estágio de corte para fatiar.
- Corte um pequeno pedaço de ágar 3% de aproximadamente 1 cm3 para usar como batente para o cérebro e 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm para uma protuberância a ser usada para sustentar o colículo inferior (IC).
- Cole o batente no palco com adesivo de cianoacrilato, bem como a saliência no lado direito do batente de modo que formem um ângulo de 80o.
- Remova o cérebro.
- Anestesiar profundamente um camundongo pós-natal dia 12 - dia pós-natal 20 (p12-p20, idealmente p14-18) com cetamina 100 mg/kg e xilaxina 3 mg/kg (ou procedimento aprovado pelo comitê de ética comparável).
nota: Confirme o nível adequado de anestesia por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé. Como o animal está sob anestesia brevemente, a pomada oftálmica é desnecessária.
- Usando uma tesoura de ponta romba, exponha a caixa torácica do processo xifóide ao pescoço.
- Encontre o processo xifóide e faça um corte horizontal de aproximadamente 1,5 cm.
- Faça dois cortes verticais das extremidades do corte horizontal anterior até os ombros, aproximadamente 1,5 cm cada.
- Corte o diafragma e as junções costocondrais para expor o coração.
- Com uma pequena tesoura de mola, faça um pequeno corte de 2 a 5 mm no átrio direito, do lado ventral para o dorsal do coração.
- Usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 27G x 1/2 polegada, injete o ventrículo esquerdo e perfunda rapidamente o animal com uma solução de corte com alto teor de sacarose.
- Quando o sangue estiver limpo, use uma tesoura maior para remover a cabeça.
nota: Não avaliamos sistematicamente a utilidade da perfusão. No entanto, em nossa experiência, a perfusão transcardíaca em camundongos tão jovens pode ser feita com quase 100% de sucesso e tem o benefício de eliminar os glóbulos vermelhos, que podem fluorescer e interferir na imagem.
- Corte a pele na linha média para expor o crânio.
- Usando uma tesoura de íris dobrada, corte o crânio entre os olhos e, a partir do corte entre os olhos, corte cuidadosamente de anterior para posterior ao longo da sutura da linha média, tomando cuidado para não danificar o cérebro por baixo.
nota: A dura-máter geralmente sai com o crânio. Se necessário, remova a dura-máter antes de remover cuidadosamente o cérebro.
- Usando uma pinça de joalheiro, abra o crânio e remova cuidadosamente o cérebro, depois coloque o cérebro na solução de corte. Tome cuidado para não danificar os córtices.
2. Preparando o cérebro para fatiar
- Preparando o cérebro para montagem no estágio vibrato.
- Usando um slide marcado com duas linhas a 90o e uma linha diagonal a 17o do canto superior esquerdo para o canto inferior direito, cruzando onde as duas linhas se encontram, coloque o lado dorsal do cérebro para cima, usando uma lâmina de barbear, remova 2-4 mm do cérebro final rostral criando uma superfície plana.
- Coloque o lado caudal do cérebro para cima na superfície plana recém-criada e alinhe a superfície dorsal do cérebro com a horizontal e a linha média do cérebro com a linha vertical.
- Alinhe a lâmina de barbear com a linha de 17o, incline a navalha em um ângulo de 30o e remova aproximadamente 3 mm do córtex direito em um corte diagonal duplo (17o do plano horizontal e 60o do coronal).
- Cérebro de montagem no palco vibrato.
- Coloque um pequeno pedaço de papel de filtro de 1 cm x 2 cm no lado ventral do cérebro, de modo que a dimensão longa seja perpendicular à linha média.
- Aplique cuidadosamente uma pequena quantidade de adesivo de cianoacrilato na área em frente ao batente (e à esquerda da saliência).
- Coloque a face do cérebro cortada diagonalmente na cola de modo que a parte caudal do cérebro e o rombencéfalo fiquem apoiados na protuberância e o lado direito do cérebro fique contra o recuo.
- Pressione delicadamente o cérebro, garantindo que toda a superfície esteja em contato com a câmara de corte.
3. Obtenção da fatia colículo-tálamo-cortical
- Pegue rapidamente o estágio de corte e coloque no vibratome, preencha o estágio com solução de corte.
- Alinhe a lâmina com a parte superior (lado ventral) do cérebro.
- Remova 1-1,5 mm da parte superior do cérebro, remova fatias de 300-500 μm e avalie a profundidade após a remoção.
Nota: Quando o CI, o corpo geniculado medial (MGB) e o núcleo geniculado lateral (LGN) são todos visíveis, e o giro dentado forma uma forma de 'C', leva de um a dois cortes de 600 μm. Veja a Figura 1A.
- Coloque as fatias na câmara de retenção aquecida (32 oC).
