Indução in vitro de junções neuromusculares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos projetadas

Resumo

Fonte:Lin, C. et al., Junção neuromuscular in vitro induzida a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. (2020).

Este experimento detalha um método para gerar junções neuromusculares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Ele usa um processo de diferenciação em estágios para promover o desenvolvimento do miotubo e do neurônio motor e a formação de sinapses, produzindo junções neuromusculares funcionais.

Protocolo

1. Preparação de placas revestidas com matriz extracelular (MEC)

1. Dilua o ECM (consulte a Tabela de Materiais) com 1x PBS gelado até uma concentração final de 2%
2. Adicione 1 mL de ECM a 49 mL de 1x PBS em um tubo plástico de 50 mL. Misture bem pipetando para cima e para baixo várias vezes.
3. Coloque 1 lamínula em cada poço de uma placa de 6 poços. Adicione 1,5 mL de ECM a 2% em cada poço.
4. Incubar a placa do poço com 2% de ECM por 2 h a 37 °C.
5. Aspirar a ECM da placa do alvéolo e conservar a placa a 4 °C antes da utilização.

2. Diferenciação de iPSCs em relação a NMJ

1. Semeie 4 x 10⁵ de iPSCs por poço na placa de 6 poços preparada na seção 1. Certifique-se de semear as células na lamínula pré-depositada no poço.
   nota: Neste estudo, foi utilizada a linhagem celular 201B7^MYOD iPS.
   1. Remova o meio das iPSCs na placa de cultura de 6 cm e lave as iPSCs uma vez com 1x PBS.
   2. Adicione 1 ml de solução de descolamento de células à placa e incube durante 10 min a 37 °C.
   3. Adicione 3 mL de meio de células-tronco embrionárias (ES) de primatas ao prato e pipete suavemente 3 vezes.
   4. Recolha o sobrenadante, que contém iPSCs destacados, num tubo de plástico de 50 ml e centrifugue a 160 x g a 4 °C durante 5 min.
   5. Aspire cuidadosamente o sobrenadante, ressuspenda as iPSCs em meio de células ES de primatas de 3 mL com 10 μM de Y27632 e conte o número de células usando um hemocitômetro.
   6. Diluir as iPSCs com meio de células ES de primatas e 10 μM de Y27632 até uma concentração de 2 x 10⁵ células/ml. Adicione 2 mL de iPSCs na lamínula pré-depositada no poço descrito na seção 1.

3. Indução das iPSCs ao NMJ

1. No dia 1, 24 h após a semeadura das iPSCs na placa de 6 poços, remova o meio de cultura e substitua-o por 2 mL de meio de células ES de primatas frescos contendo 1 μg / mL de doxiciclina em cada poço.
2. Troque o meio com 2 mL de meio de diferenciação miogênica (MDM) (Tabela 1) contendo 1 μg / mL de doxiciclina (concentração final) para cada poço. Atualize o meio todos os dias do dia 2 ao dia 10.
3. A partir do dia 11, mude o meio para 2 mL de meio NMJ (Tabela 1) para cada poço. Atualize o meio a cada 3 a 4 dias até o dia 30.
4. Observe a JNM diferenciada por microscopia de fase invertida no dia 30. O NMJ pode ser usado para a análise a seguir.

Resultados

Tabela 1: Fórmula do meio.

Meio de diferenciação miogênica (MDM)	MEM-alfa	500mL
	100mM 2-ME	1117μL
	Doxiciclina	1μg/mL
	Ksr	56mL (final a 10%)
	Caneta / estre...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio, factores de crescimento e reagentes
2-mercaptoetanol	Tesque de Nacalai	Rolamento 21418-42
B27, Gibco	Gibco	12587-001
BDNF	Sistemas de P&D	248-BD
Solução de descolamento celular, Accumax	Tecnologias STEMCELL	#07921
Secador de ponto crítico	Hitachi	ES-2030
Doxiciclina	Takara	631311
ECM, Matrigel (fator de crescimento reduzido)	Corning	Rolamento 356230
GDNF	Sistemas de P&D	212-GD
Gelificação, gel IP	Cajado Geno	Pág. 20-1
Revestidor de íons	JEOL	JEC3000FC
Meio iPSC, mTeSR	Tecnologias STEMCELL	85850
Nocaute SR (KSR)	Gibco	Rolamento 10828-028
Microscopia de células vivas	Nikon		Microscópio Eclipse Ti
MEM-alfa	Gibco	12571-071
N2, Gibco	Gibco	17502-048
Meio neurobasal	Gibco	Rolamento 21103-049
NT3	Sistemas de P&D	267-N3
Meio celular ES de primatas	ReproCell	RCHEMD001
SEM	Hitachi	S-4700
TEM	Hitachi	H7650
Y27632	Wako Chemicals GmbH	253-00513