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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Configuração experimental
- Antes de iniciar a colheita de tecidos e células, verifique se todas as ferramentas são estéreis. Se necessário, autoclave uma tesoura cirúrgica afiada, uma pinça muito fina e uma pinça padrão fina. Além disso, conforme apropriado, esterilize cada substrato antes da semeadura celular usando esterilização UV, exposição ao etanol ou esterilização a vapor.
- Preparação de meios e soluções de estoque para colheita e dissociação de neurônios
- Prepare o meio de Bottenstein e Sato (BS), adicionando 1% de penicilina-estreptomicina (PS) e 1% de suplemento de N2 ao meio F12 de Ham. Calcule o volume final necessário como 500 μl por poço (se estiver usando uma placa de 24 poços).
- Preparar as reservas de colagenase IV em meio F12 de Ham na concentração de 1,25% em peso/v. Filtrar a solução e conservar a -20 °C sob a forma de alíquotas de 200 μl.
- Preparar as reservas de tripsina pancreática bovina em meio F12 de Ham na concentração de 2,5% em peso/v, filtrar-esterilizar e conservar a -20 °C sob a forma de alíquotas de 200 μl.
- Preparar a solução-mãe do factor de crescimento nervoso (NGF) na concentração de 5 μg/ml numa solução de albumina de soro bovino (BSA) isenta de ácidos gordos (BSA) esterilizada por filtro em meio F12 e conservar a -20 °C sob a forma de alíquotas de 200 μl. Não filtre o NGF após a reconstituição.
- Caso nenhuma modificação da superfície tenha sido realizada, cubra lamínulas/placas com poli-D-lisina (0,1 mg/ml por 15 min em temperatura ambiente [RT]) e/ou laminina (2-10 μg/cm2 por 2 horas a 37 °C) para apoiar a fixação dos neurônios e o crescimento dos neuritos, conforme apropriado.
- Sempre aqueça o meio em banho-maria a 37 °C antes de usar.
2. Colheita e dissociação de neurônios dos gânglios da raiz dorsal (DRG)
- Terminar o rato por luxação cervical e decapitação. Raspe o rato e levante a pele para expor a coluna vertebral. Usando uma tesoura afiada, excise a coluna vertebral tomando cuidado extra com os órgãos confinados e vasos sanguíneos. Transferir a coluna vertebral para uma cabina de segurança biológica (classe II) utilizando uma placa de Petri e remover a parte dorsal.
- Divida a coluna vertebral ao meio ao longo do eixo longitudinal usando uma tesoura cirúrgica estéril e afiada para expor o tecido do cordão. Neste ponto, é útil cortar a coluna vertebral em dois segmentos menores abaixo do nível da caixa torácica, para facilitar o manuseio durante a coleta do neurônio DRG. Usando uma pinça fina, remova suavemente todo o tecido do cordão, prestando atenção para não puxar e remover as raízes do DRG. Desta forma, o DRG e as raízes ficarão expostos dentro dos canais vertebrais, ainda envoltos na coluna. Observe o DRG como filamentos brancos saindo diretamente dos canais.
- Retire toda a raiz do DRG (não apenas o DRG) dos canais vertebrais usando uma pinça muito fina, penetrando profundamente nos canais vertebrais e prestando atenção para não danificar as raízes dos gânglios. Transferir o DRG para uma pequena placa de Petri (60 mm2) contendo 3-4 ml de meio F12 de Ham suplementado com 1% de PS. Se estiver usando animais diferentes, use pratos separados.
- Sob um microscópio de dissecação, limpe o DRG de qualquer excesso de raízes nervosas ao redor dos gânglios usando uma pinça estéril e um bisturi para reduzir a contaminação das células gliais. Transferir o DRG para uma pequena placa de Petri (35 mm2) com 1,8 ml de meio F12 fresco.
- Adicione 200 μl de solução estoque de colagenase tipo IV a 1,25% em peso / v (concentração final de 0,125%) e incube o DRG a 37 ° C, 5% CO2 por 1 hora. Aspire cuidadosamente o meio com uma pipeta de vidro, prestando atenção para não aspirar ou danificar o DRG. Adicione meio F12 fresco suplementado com enzima colagenase tipo IV a 0,125% em peso / v e incube por 1 hora conforme descrito anteriormente.
- Aspire o meio e lave suavemente o DRG com meio F12. Adicione então 1,8 ml de meio F12 e 200 μl de tripsina (concentração final de 0,25% em peso / v) e incube a 37 ° C, 5% CO2 por 30 min.
- Remova a tripsina e adicione 1 ml de meio F12 suplementado com 500 μl de soro fetal bovino (FBS) para interromper a reação enzimática. Aspire o meio e lave suavemente o DRG com meio F12 por três vezes para remover vestígios de soro.
- Adicione 2 ml de meio F12 fresco e transfira cuidadosamente o DRG com o meio para um tubo de 15 ml usando uma pipeta de vidro. Dissocie suavemente os neurônios DRG pipetando para cima e para baixo (cerca de 8 a 10 vezes) com a pipeta de vidro (pontas de plástico podem ser usadas como alternativa).
- Deixe o pellet assentar no fundo do tubo e colete o meio em um novo tubo. Adicionar 2 ml de meio F12 fresco ao tubo que contém o pellet e repetir a dissociação mecânica com a pipeta de vidro. Repita esta etapa até que a suspensão se torne homogênea (cerca de 3-4 vezes) e colete todo o DRG dissociado no novo tubo. Este método reduz o estresse decorrente da dissociação mecânica e melhora a viabilidade dos neurônios.
- Filtrar a suspensão homogeneizada resultante para um novo tubo de 15 ml, utilizando um filtro de células de 100 μm para remover os neurónios não dissociados e outros detritos. Nesta fase, pode ser conveniente filtrar primeiro a suspensão celular para um tubo de 50 ml e, em seguida, transferir a solução para o tubo menor usando uma pipeta de vidro. Centrifugar a suspensão a 110 g durante 5 min.
- Prepare um BSA a 15% adicionando 500 μl de uma solução de BSA a 30% a 500 μl de meio F12. Pipete lentamente a solução pela parede de um tubo de 15 ml para criar um rastro gradual de proteínas. Nesta fase, é útil segurar o tubo em um ângulo de 45° e liberar lentamente o BSA usando os números no tubo de falcão como referência para a "trilha" de formação.
- Aspirar o sobrenadante do passo 2.10 deixando 500 μl no fundo do tubo e ressuspender o sedimento celular no mesmo meio. Pipetar lentamente a suspensão ao longo do rasto de proteínas previamente preparado no passo 2.11 (utilizar os números do tubo como referência) e centrifugar a 500 g durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de meio BS modificado.
nota: O volume para ressuspender os neurônios DRG pode ser feito até o volume real necessário, dependendo da concentração celular final desejada e do número de amostras a serem semeadas. Um animal fornecerá células suficientes para um experimento de placa de 24 poços.
- Incubar as amostras semeadas a 37 °C, 5% de CO2 durante 2 horas para permitir a fixação das células e, por fim, adicionar meio BS fresco suplementado com 50 ng/ml de NGF.