1. Manutenção de células-tronco
NOTA: O protocolo de manutenção celular descrito abaixo se aplica a células-tronco pluripotentes (PSCs) mantidas em uma monocamada aderente. Meios, outros reagentes e placas de cultura de células usados antes do tratamento com dimetilsulfóxido (DMSO) podem ser ajustados conforme necessário. Para todos os protocolos a seguir neste manuscrito, as células devem ser manuseadas sob um gabinete de segurança biológica.
- Cubra placas estéreis, 6 poços, tratadas com cultura de tecidos com uma matriz ou substrato qualificado por células-tronco pluripotentes preparado de acordo com as instruções do fabricante e incube por pelo menos 1 h em uma incubadora de CO2 (5% de CO2, atmosfera úmida). As placas revestidas podem ser embaladas em filme e armazenadas a 4 °C por até uma semana.
- Descongele as PSCs criopreservadas em banho-maria a 37 °C. Esterilize o frasco com etanol antes da introdução no gabinete de segurança biológica e, em seguida, transfira imediatamente as células pipetando para um tubo cônico estéril contendo 5-10 volumes de meio de células-tronco pré-aquecido.
- Centrifugue as células a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT).
- Aspire o meio e ressuspenda suavemente o pellet celular em 1 mL de meio de células-tronco suplementado com um inibidor de proteína quinase associada a rho (ROCK) de 10 μM, como Y-27632.
- Aspire a matriz de cultura da placa e semeie as células na densidade desejada, normalmente 0,5-1 x 106 células por poço em pelo menos 2 mL de meio de células-tronco por poço.
nota: A densidade do plaqueamento pode variar entre diferentes linhagens celulares e clones e deve ser otimizada de acordo.
- Mantenha as células substituindo-as por meios de células-tronco pré-aquecidos diariamente. Divida as células em aproximadamente 70% -80% de confluência ou quando as colônias de células começarem a fazer contato.
- Para dividir as células, aspire o meio e lave as células uma vez com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Incubar as células com 1 ml de uma solução enzimática de dissociação por alvéolo durante 5-10 minutos a 37 °C.
- Lave e ressuspenda as células com meio de células-tronco pré-aquecido e transfira para um tubo cônico estéril com 5-10 volumes de meio de células-tronco. Siga as etapas 1.3-1.7 para colocar as células em placas.
2. Pré-tratamento com DMSO
NOTA: Ao plaquear as células para pré-tratamento com DMSO antes da diferenciação, a densidade celular inicial do plaqueamento deve ser otimizada levando em consideração a taxa de crescimento típica da linhagem de células-tronco, bem como o protocolo de diferenciação que está sendo usado. Valide a pluripotência usando marcadores convencionais, conforme necessário. As células devem ser passadas pelo menos 1x-2x após o descongelamento inicial antes da diferenciação.
- Diferenciação de cultura 2D
- Quando as células atingirem uma confluência apropriada, prepare placas revestidas, dissocie as células e prepare uma suspensão unicelular conforme descrito acima.
- Conte as células vivas usando um hemocitômetro ou contador automático de células, incluindo azul de tripano ou outro marcador de viabilidade.
- Coloque as células em uma placa revestida de 6 poços a 0,5-1 x 106 células por poço em meio de células-tronco com o inibidor ROCK de 10 μM.
NOTA: Para as linhagens celulares testadas em nosso laboratório, essas densidades normalmente resultaram em 80% -90% de células confluentes dentro do pré-tratamento de DMSO de 24 horas.
- Deixar as células incubarem durante 24 h a 37 °C numa incubadora de CO2 (5% de CO2, atmosfera húmida).
- Prepare 1% -2% de DMSO em meio de células-tronco pré-aquecido (por exemplo, 100 μL de DMSO em 10 mL de meio = solução de DMSO a 1% ou 200 μL de DMSO em 10 mL de meio = solução de DMSO a 2%).
- Após 24 h de incubação, aspirar o meio das células e substituí-lo por solução de DMSO.
- Deixar as células incubarem durante 24 h a 48 h a 37 °C numa incubadora de CO2 (5% de CO2, atmosfera húmida) antes da diferenciação.
NOTA: Normalmente, um tratamento com DMSO de 24 horas é suficiente na maioria das linhagens de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas (ESC e iPSC). Linhagens celulares com taxas de crescimento muito lentas (longos tempos de duplicação) podem se beneficiar da incubação de 48 h com DMSO. Para uma incubação de 48 h com DMSO, o meio pode ser substituído por meio de células-tronco frescas com 1%-2% de DMSO após as primeiras 24 h de tratamento.
3. Diferenciação para camadas germinativas primárias
NOTA: O seguinte descreve métodos anteriormente demonstrados como eficazes em nosso laboratório para PSCs cultivados em monocamada em placas de 6 poços. Qualquer protocolo de diferenciação de escolha deve ser usado após o tratamento com DMSO para promover a diferenciação nas linhagens desejadas. Remova a solução de DMSO após um tratamento de 24-48 h e prossiga com a diferenciação seguindo os protocolos padrão.
- Diferenciação de ectoderma
- Pré-trate as células com DMSO conforme descrito acima para culturas 2D.
- Prepare Noggin e SB431542 soluções de estoque.
- Prepare o meio de base de diferenciação ectodérmica dissolvendo a reposição do soro knockout (KOSR) até uma concentração final de 10% no meio Eagle modificado de Dulbecco knockout (DMEM).
nota: Prepare mídia base suficiente para 3-4 dias de troca de mídia.
- Prepare os meios de diferenciação ectodérmica adicionando Noggin a uma concentração final de 500 ng / mL e SB431542 a uma concentração final de 10 μM ao volume apropriado de KOSR / DMEM nocaute pré-aquecido.
- Após o pré-tratamento com DMSO, aspire os meios das células e substitua por meios de diferenciação (por exemplo, 2 mL por poço de uma placa de 6 poços).
- Deixar as células incubarem durante 3-4 dias a 37 °C numa incubadora de CO2 (5% de CO2, atmosfera húmida), substituindo diariamente o meio por factores de diferenciação recém-adicionados.