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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação de tampões de dissecação e meios de cultura
- Para o isolamento da medula espinhal de rato, prepare 100 ml de tampão de dissecção (1x PBS + glicose a 0,6% + penicilina-estreptomicina a 2%) e leve à geladeira.
- Preparar 100 ml de meio isento de soro (SFM) e aquecer a 37 °C. Para preparar o SFM, adicione 2 mM de L-glutamina, 100 μg / ml de penicilina-estreptomicina, 2% de B27 e 10% de mistura hormonal ao meio Neurobasal-A. Para preparar a mistura hormonal, faça um meio DMEM/F12 1:1 contendo 0,6% de glicose, 3 mM de NaHCO3, 5 mM de HEPES, 25 μg/ml de insulina, 100 μg/ml de apo-transferrina, 10 μM de putrescina, 30 nM de selênio e 20 nM de progesterona.
- Prepare o meio de plaqueamento enriquecido com fator de crescimento EFH (ao SFM adicione 20 ng/ml de EGF, 20 ng/ml de bFGF e 2 μg/ml de heparina) e aqueça a 37 °C.
2. Colheita e Dissecção de Tecido Espinhal Periventricular de Rato Adulto
- Esterilize os instrumentos de dissecação em etanol e enxágue com solução salina estéril ou instrumentos de autoclave com antecedência. Dê aos ratos (6 a 8 semanas de idade) uma injeção letal de pentobarbital sódico (1 cc a 65 mg / ml) ou uma overdose de anestésico (ou seja, isoflurano a 4%) de acordo com o protocolo animal aprovado pela instituição. Molhe o dorso do rato com etanol a 70% e remova a pele da superfície dorsal com uma tesoura de dissecção grande.
- Segurando a tesoura perpendicularmente à superfície dorsal, corte transversalmente a coluna vertebral acima dos membros posteriores. Use uma tesoura menor para cortar longitudinalmente o músculo dorsal que cobre a coluna vertebral na direção rostral para expor os processos espinhosos.
- Começando na extremidade caudal exposta, insira rongeurs ou um pequeno instrumento de corte ósseo rombudo extraduralmente na face lateral do canal espinhal, no espaço entre a medula espinhal e a coluna vertebral. Faça pequenos cortes na lâmina (arcos ósseos à esquerda e à direita dos processos espinhosos de cada lado das vértebras) e retire cuidadosamente a lâmina para expor a medula espinhal (Figura 1A-D). Certifique-se de que o ângulo das lâminas seja raso e paralelo ao cordão para que a medula espinhal subjacente não seja danificada.
- Continue a laminectomia na direção rostral para expor a medula espinhal torácica e cervical.
- Extirpe suavemente a medula espinhal da coluna vertebral com uma pinça de tecido rombudo e use uma microtesoura para cortar cuidadosamente as raízes e liberar o cordão. Colocar a medula espinhal excisada numa placa de Petri contendo tampão de dissecação estéril de rato a 4 °C (descrito no ponto 1.1). Enxágue o tecido em tampão de dissecação a 4 ° C recém-preparado e corte a medula espinhal transversalmente em segmentos de 1 cm usando uma tesoura ( Figura 1E ).
- Para cada segmento de tecido, use uma mão para segurar o tecido com uma pinça fina. Com a outra mão, use uma microtesoura para remover cuidadosamente as meninges sobrepostas, a substância branca e a maior parte da substância cinzenta com o auxílio de um escopo de dissecação. Alternativamente, use uma pinça fina (Dumont # 4) para descascar a maior parte da substância cinzenta e branca, deixando apenas a região periventricular da medula espinhal, que inclui o epêndima e uma pequena quantidade de substância cinzenta circundante ( Figura 1F-H ).
- Agrupe o tecido periventricular dissecado em uma placa de Petri estéril de 10 cm contendo tampão de dissecção fria de ratos.
3. Isolamento e Cultura de NSPCs da Medula Espinhal de Ratos Adultos
- Execute as etapas a seguir assepticamente em uma capela de fluxo laminar.
- Pique o tecido periventricular dissecado do rato em pedaços de 1 mm com uma microtesoura.
- Dissociar enzimaticamente o tecido picado com enzimas proteolíticas usando o kit de dissociação de papaína conforme indicado na tabela de materiais/reagentes.
nota: Os componentes do reagente incluem quatro frascos: Frasco 1: Solução salina balanceada de Earle (EBSS). Frasco 2: Papaína contendo L-cisteína e EDTA. Frasco 3: Desoxirribonuclease I (DNase). Frasco 4: Inibidor de protease ovomucóide com albumina de soro bovino (BSA).
NOTA: A papaína é uma protease sulfidrila com ampla especificidade para substratos proteicos. A papaína aqui é derivada do látex da planta Carica papaya e degrada a maioria dos substratos proteicos mais extensivamente do que as proteases pancreáticas. Durante o processo de dissociação, há algum dano celular fazendo com que o DNA seja liberado no meio de dissociação, o que aumentará a viscosidade e dificultará a pipetagem. Assim, a DNase é incluída no procedimento de isolamento celular para digerir o DNA sem danificar as células intactas. Os ovomucoides são inibidores da glicoproteína protease usados para inibir a atividade da papaína após a etapa de dissociação.
- Na primeira utilização, reconstituir a mistura de inibidores da albumina ovomucóide (frasco para injetáveis 4) com 32 ml de EBSS (frasco para injetáveis 1) e, em seguida, conservar a 4 °C e utilizar para isolamentos subsequentes. nota: Isso produz uma solução a uma concentração efetiva de 10 mg de inibidor de ovomucóide e 10 mg de albumina por ml.
- Adicione 5 ml de EBSS (frasco 1) ao frasco para injetáveis de papaína (frasco 2), produzindo uma solução a 20 unidades de papaína/ml em L-cisteína 1 mM com EDTA 0,5 mM. Verifique se a solução de papaína parece clara quando completamente dissolvida. Caso contrário, coloque o frasco em banho-maria a 37 °C durante dez minutos até que a papaína esteja completamente dissolvida para garantir a atividade total da enzima.
- Adicione 500 μl de EBSS (frasco 1) ao frasco DNase (frasco 3) e misture suavemente, pois o DNase é sensível à desnaturação por cisalhamento. Adicione 250 μl da solução de DNase ao frasco para injetáveis de papaína, resultando em uma concentração final de aproximadamente 20 unidades/ml de papaína e 0,005% de DNase. Salve o DNAse restante para uso posterior.
- Coloque o tecido de rato picado na solução de papaína.
- Incubar a 37 °C com agitação constante numa plataforma basculante para dissociar o tecido na solução de papaína ativada. Incube o tecido do rato por 45 min a 1 hora.
- Triturar a mistura com uma pipeta de 10 ml para dissociar quaisquer pedaços de tecido remanescentes para obter uma suspensão de células turvas. Transferir a suspensão celular (não incluir quaisquer pedaços de tecido não dissociado) para um tubo cónico estéril de 15 ml e centrifugar a 300 x g durante 5 min à RT.
- Ressuspenda as células peletizadas em meio contendo ovomucóide, um inibidor da papaína.
- Preparar a solução ovomucóide misturando 2,7 ml de EBSS (frasco 1) com 300 μl da solução reconstituída de inibidor da albumina-ovomucóide (frasco 4) num tubo cónico de 15 ml. Adicionar 150 μl de solução de DNase (frasco para injetáveis 3).
- Rejeitar o sobrenadante das células peletizadas e ressuspender imediatamente o sedimento celular na mistura diluída de inibidores de albumina DNase.
- Separe as células intactas das membranas celulares por centrifugação através de um gradiente de densidade descontínuo de etapa única.
- Preparar o gradiente de densidade descontínuo adicionando 5 ml de solução inibidora de albumina (frasco para injetáveis 4) a um tubo de 15 ml e, utilizando uma pipeta de 5 ml, colocar suave e lentamente a suspensão celular (preparada como descrito acima) sobre a solução inibidora de albumina.
- Centrifugue a 70 x g por 6 min em RT.
nota: A interface entre as duas camadas do gradiente deve ser claramente visível, embora a mistura mínima neste limite não afete o resultado. Fragmentos de membrana permanecem na interface e células dissociadas se espalham no fundo do tubo.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 ml de meio EFH de rato (pré-aquecido a 37 °C). Contar a densidade de células vivas com um hemocitômetro e colocar as células em um frasco de cultura T25 com densidade de 10 células/μl em EFH. O rendimento típico de células de tecido de rato é de cerca de 2 x 106 células com cerca de 80% de viabilidade. Se forem desejadas culturas clonais, semear células com densidade inferior a 10 células/μl. Incubar os frascos a 37 °C em CO2 a 5% e deixar as culturas crescerem sem perturbações durante 1 semana para evitar a agregação de esferas.
