Isolando e cultivando pericitos cerebrais de camundongos

Resumo

Fonte: Mehra, A., et al., Um método de alto rendimento para isolar pericitos cerebrais de camundongos. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra um método para isolar pericitos cerebrais de um cérebro de camundongo. As células isoladas são cultivadas em meios específicos de pericitos para promover a proliferação de pericitos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Preparação das soluções

1. Prepare 500 mL de tampão de lavagem A (WBA): solução HEPES 10 mM em solução salina balanceada de Hank (HBSS). Conservar a 4 °C.
2. Prepare 500 mL de tampão de lavagem B (WBB): albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% com solução de HEPES 10 mM em HBSS. Conservar a 4 °C.
3. Prepare 300 mL de solução de dextrano a 30% em WBA misturando a solução durante a noite à temperatura ambiente. Autoclave a solução a 110 °C durante 30 min antes de utilizar. Após a autoclavagem, deixe a solução descansar em temperatura ambiente por 2-3 h. Conservar a solução a 4 °C.
4. Prepare 100 mL de solução de BSA a 0,1% em solução fria de dextrana. Agitar vigorosamente durante 3-4 min e conservar a 4 °C.
5. Prepare o meio de cultura Modified Eagle Medium (DMEM) completo de Dulbecco dissolvendo 20% de soro de bezerro, 2 mM de glutamina, 50 μg / mL de gentamicina, 1% de vitaminas, 2% de aminoácidos Basal Medium Eagle (BME) em meio DMEM basal e armazene a 4 ° C. Adicione 1 ng / mL de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) antes de usar.
6. Prepare o meio completo do pericito adicionando suplementos de crescimento de pericitos (fornecidos com o meio do pericito) e 20% de soro fetal de bezerro (FCS) em meio basal de cultura de pericito e armazene a 4 ° C.

2. Recuperação do tecido cerebral e remoção de meninges

1. Para consistência, use camundongos de idade semelhante e mesmo sexo em cada lote de extração. Use um abrigo de animais livre de patógenos e forneça acesso ad libitum à água. Para garantir a eficiência e o uso mínimo de animais, evite a perda de material tecidual.
2. Eutanasiar C57BL/6J, 4-6 semanas de idade, camundongos machos (Janvier labs, Le Genest-Saint-Isle, França).
3. Extirpar rapidamente o tecido cerebral em condições estéreis, evite qualquer dano ao tecido. Coloque cuidadosamente o tecido em 40 mL de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS).
4. Transfira o tecido cerebral em PBS frio para uma placa de Petri (100 mm x 15 mm).
5. Coloque o tecido cerebral em um lenço estéril e seco sem fiapos e, com uma pinça de ponta curva, remova o cerebelo, o estriado e os nervos occipitais.
   1. Remova todas as meninges visíveis com um cotonete. Coloque o tecido cerebral de cabeça para baixo e abra os lóbulos com um cotonete usando movimentos leves para fora. Remova todos os vasos sanguíneos visíveis.
   2. Colocar o tecido cerebral livre de meninges em uma placa de Petri (100 mm x 15 mm) com 15 mL de leucócitos frios.

3. Homogeneização

1. Transfira o tecido para um tubo de argamassa trituradora de lenços Dounce e adicione 3-4 mL de WBB com fórceps.
2. Pique o tecido com um pilão 'solto' 55 vezes. Lave o pilão 'solto' com WBB. Agora pique a pasta com um pilão "apertado" 25 vezes.
3. Divida a pasta igualmente em dois tubos de 50 mL e adicione 1,5x o volume de frio 30% BSA-dextrano, agitando vigorosamente os tubos para misturar a pasta.

4. Isolamento da fração vascular

1. Depois de agitar vigorosamente os tubos, centrifugue os tubos por 25 min a 3.000 x g e 4 °C.
2. Transfira o sobrenadante (junto com a camada superior de mielina) para 2 novos tubos e centrifugue os tubos por 25 min a 3.000 x g e 4 ° C. Preserve os pellets da primeira centrifugação adicionando 3 mL de WBB frio (mantenha o pellet a 4 ° C).
3. Repita a etapa 4.2 e preserve cuidadosamente os pellets da 2ª centrifugação.
4. Rejeitar o dextrano e a mielina com restos de tecido dos tubos do passo 4.3. Preserve os pellets em WBB frio.
5. Agrupar o conteúdo do tubo 1 e do tubo 2 do passo 4.1 e completar o volume final de 10 ml com leucócitos frios.
6. Repita esta etapa para tubos da etapa 4.2 e da etapa 4.3.
   NOTA: Finalmente, existem 3 tubos de 3 centrifugações.
7. Dissocie o pellet usando 6 movimentos para cima e para baixo usando uma pipeta de 10 mL até que não haja aglomerados visíveis de pellets.
8. Filtre as suspensões celulares de cada tubo usando um conjunto de filtro a vácuo e um filtro de malha de nylon.
   nota: Esta etapa de filtragem é importante para remover vasos mais longos/maiores através do filtro de malha.
9. Recupere e ressuspenda os capilares raspando o filtro com a ajuda de uma pinça de ponta plana ou um raspador em WBB à temperatura ambiente. Filtre a suspensão com um filtro novo para recuperar mais capilares
10. Divida o filtrado igualmente em dois tubos e centrifugue por 7 min a 1.000 x g e RT.
    NOTA: Durante esta etapa de centrifugação, prepare a solução enzimática. Determinar o volume de WBB necessário de acordo com o número de animais utilizados (ver Tabela de Materiais). Adicionar 1x de DNase 1 e 1x de cloridrato de tosil-L-lisil-clorometano (TLCK) (ver Tabela de Materiais) em WBB e pré-aquecer a 37 °C.
11. Colete os pellets da etapa 4.10 em um tubo com WBB pré-aquecido com enzimas. Adicione 1x colagenase / dispase pré-aquecida. Coloque o tubo no banho-maria da mesa vibratória a 37 °C por precisamente 33 min.
12. Pare a reação enzimática adicionando 30 mL de WBB frio. Centrifugue a suspensão por 7 min a 1.000 x g e RT.
13. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante e dissociar o pellet em WBB com 6 movimentos para cima e para baixo utilizando uma pipeta de 10 ml. Esta etapa deve ser menos rigorosa e comparativamente mais rápida.
14. Centrifugue a suspensão por 7 min a 1.000 x g e RT.
    NOTA: Durante esta etapa, descarte o revestimento das placas de cultura e enxágue-as uma vez com DMEM em temperatura ambiente. Cubra as placas de cultura de células durante, pelo menos, 1 h à temperatura de incubação.
15. Rejeitar o sobrenadante do tubo obtido no passo 4.14 e dissociar o pellet num novo meio DMEM completo, plaquear as células (Dia 0, P0) em 9 poços de placas de 6 poços (1 poço de 9,6 cm2 cada).

5. Proliferação de pericitos cerebrais

1. Manter as culturas de células a 37 °C e 5% de CO₂ numa incubadora estéril. Substitua o meio de cultura após 24 h (dia 1) de plaqueamento das células, removendo cuidadosamente os detritos. Após o dia 1, troque os meios de cultura a cada 48 h.
2. Observe a cultura de células por pelo menos 7-8 dias. A essa altura, os crescimentos celulares no topo da unicamada endotelial devem ser observáveis.
3. Passe as células no dia 8-10 (dependendo da confluência) em meio de cultura de pericito para a passagem 1 (P1) em placas de cultura revestidas de gelatina. Troque os meios de cultura a cada 2 dias. Observe as células por 6-7 dias. As células são divididas consecutivamente novamente para a passagem 2 (P2) no dia 17 [e passagem 3 (P3) no dia 24 somente se necessário], cultivadas em meio pericito em placas revestidas de gelatina.
   nota: As células devem estar prontas para experimentos/observação com quase 80-90% de confluência.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aminoácidos BME	sigma	B-6766	Conservar a 4 °C.
Mídia DMEM basal	Invitrogen	316000083	Conservar a 4 °C.
Fator básico de crescimento de fibroblastos	sigma	F-0291	Conservar a -20 °C.
Bsa	sigma	A-8412	Conservar a 4 °C.
Dispersão da colagenase	sigma	10269638001	Prepare uma solução de estoque 10x em PBS-CMF estéril. Filtrar a solução com um filtro de seringa de 0,22 μm e conservar a -20 °C. Nota: Para a etapa de digestão enzimática do protocolo, para cada conjunto de 10 camundongos para extração, são necessários 300 μL de dispersão de colagenase 10x.
dextrano	sigma	Rolamento 31398
DNase I	sigma	11284932001	Prepare uma solução estoque 1000X dissolvendo 100 mg em 10 ml de água estéril e armazene a -20 ° C.
gelatina	sigma	G-2500	Prepare o revestimento de trabalho fazendo uma solução de gelatina a 0,2% em PBS-CMF estéril (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 0,2 g/L KH2PO4, 2,86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7,4). Autoclave a solução durante um mínimo de 20 minutos a 120 °C e conservar à temperatura ambiente. Placas de cultura a revestir durante, pelo menos, 4 horas a 4 °C.
Gentamicina	Biochrom AG	A-2712	Conservar a 4 °C.
glutamina	Merck	I.00289	Conservar a -20 °C.
HBSS	sigma	H-8264	Conservar a 4 °C.
HEPES	sigma	H-0887	Conservar a 4 °C.
Matrigel	BD Biocoat	Rolamento 354230	Prepare uma solução de revestimento de trabalho de Matrigel diluindo o estoque em DMEM frio na proporção de 1:48 com sua concentração final de 85 μg / cm2. As placas de cultura celular devem ser revestidas por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente.
Pericito Médio-rato	Laboratórios de pesquisa científica	1231	Conservar a 4 °C.
Tosil lisina clorometilcetona	sigma	T-7254	Prepare uma solução estoque 1000X em WBA dissolvendo 16 mg em 10,88 mL de WBA para fazer uma solução de 4 mM e armazene a 4 ° C.
Vitaminas	sigma	B-6891	Conservar a -20 °C.
Ferramentas de filtragem	Sefar, malha de nylon, porosidade de 60 mícrons
equipamento de laboratório	Centrífuga de rotor de caçamba oscilante
Banho-maria com agitador
Capuz de fluxo laminar: BSL2
Artigos de vidro (todos os componentes a serem esterilizados termicamente)	Moedor de tecido Dounce com pilão de vidro
Pilão I: 0,0035 - 0,0065 polegadas
Pilão II: 0,0010 - 0,0030 polegadas
Conjunto de filtro a vácuo com base de suporte de filtro de vidro frita de porosidade grossa