Obtenção de uma suspensão unicelular do tecido hipocampal de camundongo

Resumo

Fonte: Trujillo, M., et al. Dissociação Mecânica e Enzimática Combinada do Tecido do Hipocampo do Cérebro de Camundongos. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra um protocolo para obter uma suspensão unicelular altamente viável do hipocampo do cérebro de camundongo usando uma combinação de dissociação mecânica automatizada e uma mistura de enzimas para auxiliar na digestão enzimática.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Prepare a mistura enzimática 1 e 2 para cada amostra

NOTA: Para volumes superiores a 2 mL, use uma pipeta sorológica de 10 mL; para volumes de 200 μL-2 mL, use uma pipeta de 1000 μL; para volumes de 21-199 μL, use uma pipeta de 200 μL; para volumes de 2-20 μL, use uma pipeta de 20 μL; para volumes abaixo de 2 μL, use uma pipeta de 0-2 μL.

1. Para cada amostra, descongelar uma alíquota de cada enzima P e enzima A à temperatura ambiente.
2. Para a mistura enzimática 1, combine 50 μL de enzima P e 1900 μL de tampão Z em um tubo C rotulado (Tabela de Materiais).
3. Para a mistura enzimática 2, adicione 20 μL de tampão Y à alíquota descongelada de 10 μL da enzima A.

2. Protocolo de dissociação cerebral para adultos

NOTA: Ao trabalhar com samples, os tubos devem ser colocados em um suporte de tubos à temperatura ambiente enquanto o BSA e o D-PBS permanecem no gelo, salvo indicação em contrário.

1. Ligue o dissociador.
2. Use uma pinça para transferir os pedaços de tecido do hipocampo para o tubo C.
3. Transfira 30 μL de mistura enzimática 2 para o tubo C. Gire a tampa até sentir tensão e aperte até ouvir um clique.
4. Coloque o tubo C de cabeça para baixo em uma posição do dissociador; a amostra receberá o status Selecionado (Figura 1). Prenda o aquecedor sobre o tubo C.
5. Pressione o ícone da pasta, selecione a pasta Favoritos, role e selecione o programa 37C_ABDK_02. Clique em OK para aplicar o programa a todos os tubos C selecionados e, em seguida, toque em Iniciar (Figura 1).
6. Rotule um tubo cônico de 50 mL por amostra.
7. Coloque um filtro de células de 70 μm em cada tubo cônico de 50 mL e molhe com 2 mL de tampão BSA.
8. Após a conclusão do programa, remova o aquecedor e o tubo C do dissociador.
9. Adicione 4 mL de tampão BSA à amostra e aplique a mistura no filtro de células no tubo cônico de 50 mL.
10. Adicione 10 mL de D-PBS ao tubo C, feche-o e agite a solução suavemente. Aplique-o no filtro de células no tubo cônico de 50 mL.
11. Descarte o filtro da célula e o tubo C. Centrifugue a suspensão a 300 x g durante 10 min a 4°C. Em seguida, aspire e descarte o sobrenadante.

3. Remoção de detritos

1. Ressuspenda o pellet com 1550 μL de D-PBS frio e transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL rotulado.
2. Adicione 450 μL de solução de remoção de detritos frios e pipete para cima e para baixo (não vórtice).
   nota: A Solução de Remoção de Detritos é um reagente no Kit de Dissociação Brian Adulto comercial.
3. Cubra suavemente 1 mL de D-PBS frio no topo da suspensão celular, mantendo a ponta contra a parede do tubo cônico. Repita até que a sobreposição total seja de 2 mL.
   nota: Esta etapa é crítica; Execute com proficiência e destreza.
4. Centrifugue a 3000 x g por 10 min a 4°C com aceleração total e freio total.
   nota: Se as fases não estiverem claramente separadas, repita as etapas 7.2 a 7.3. Centrifugue uma última vez a 1000 x g por 10 min a 4 ° C.
5. A suspensão deve agora consistir em três camadas distintas (Figura 2). Aspire a camada superior. Varra a ponta da pipeta para frente e para trás para aspirar a camada intermediária branca. Remova o máximo possível da camada intermediária sem perturbar a camada inferior.
   nota: Esta etapa é crítica; Execute com proficiência e destreza.
6. Adicione 2 mL de D-PBS frio e pipete para cima e para baixo para misturar.
7. Centrifugue a 1000 x g por 10 min a 4°C com aceleração total e freio total. Aspire e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão BSA.
   NOTA: As células podem ser ressuspensas no tampão apropriado e, em seguida, marcadas magneticamente e isoladas em preparação para o sequenciamento de célula única neste momento.

Resultados

Figura 1: Status selecionado na etapa 2.4

Figura 2: Suspensão de três camadas na etapa 3.5: Tampão (camada superior), detritos celulares, solução de remoção de detritos e células (camada inferior).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Fisher Científico	02-682-003	Basix, cores sortidas
Tubos Falcon de 15 mL	Becton Dickinson Labware Europa	352009	polistireno
25 mL de pipetas sorológicas	Fisher Científico	Telefone: 14-955-235
Filtro de células de 70 μm	Fisher Científico	08-771-2
Kit de dissociação cerebral para adultos	Miltenyi Biotec	Telefone: 130-107-677	Contém Enzima P, Tampão Z, Tampão Y, Enzima A, Tampão A, Solução de Remoção de Detritos
Bsa	Sigma-Aldrich	A7906-50G
Tubos de centrífuga cônicos Falcon 50 mL	Fisher Científico	Telefone: 14-432-22
Tubos gentleMACS C	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator com aquecedores	Miltenyi Biotec	130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Copo de vidro	Fisher Científico	02-555-25A
Ponteira de pipeta GP LTS 20 μL 960A/10	Rainin	30389270
Ponteiras de pipeta GP LTS 250 μL 960A/10	Rainin	30389277
Ponteiras de pipeta RT LTS 1000 μL FL 768A/8	Rainin	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Rainin	30386597
Balde de gelo redondo com tampa	Fisher Científico	07-210-129
Tubos de fundo redondo com tampa do filtro de célula	falcão	Telefone: 100-0087