Preparando uma suspensão unicelular de células imunes a partir de tecido cerebral murino

Resumo

Fonte: DiSano, K. D., et al. Isolando tecidos do sistema nervoso central e meninges associadas para a análise a jusante de células imunes. J. Vis. Exp. (2020).

O vídeo demonstra a preparação de uma suspensão unicelular de células imunes a partir de um tecido cerebral murino. Envolve digestão enzimática para liberar células do tecido cerebral, seguida de centrifugação com gradiente de densidade para isolar as células imunes com base em suas densidades para obter a suspensão unicelular.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Preparação de suspensões unicelulares de tecido cerebral e da medula espinhal

1. Transfira o tecido cerebral ou da medula espinhal com mídia para o topo da placa de Petri de 100 mm, despejando o tecido e a mídia do tubo. Usando uma pinça, mova o tecido para o fundo da placa de Petri. Pique finamente o cérebro ou a medula espinhal com uma lâmina de barbear estéril. Usando a lâmina de barbear, mova o tecido picado para o fundo da placa raspando para recolher o tecido.
   nota: Para o protocolo de digestão enzimática abaixo, até duas medulas espinhais podem ser agrupadas para processamento. Os cérebros devem ser processados individualmente.
2. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, adicione 3 mL de RPMI (meio do Roswell Park Memorial Institute (suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS) à placa de Petri. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, pipete para cima e para baixo para ressuspender o tecido no meio e transferir para um tubo cônico de 15 mL.
   nota: Se a aplicação a jusante for análise de sequenciamento de RNA de célula única ou em massa ou cultura de células, os lotes FCS devem ser testados para garantir que as células não sejam ativadas antes da análise. Alternativamente, as células podem ser processadas usando 1x PBS com 0,04% BSA em vez de RPMI com 10% FCS.
3. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, lave a placa de Petri com mais 2 mL de meio para coletar qualquer tecido residual e transfira para um tubo cônico para um volume total de 5 mL. Mantenha os tubos congelados entre as etapas de processamento.
4. Usando uma pipeta, ressuspenda o pó de colagenase I no meio Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) para obter a concentração desejada (ou seja, 100 mg / mL). Adicionar colagenase tipo I ao tubo cônico contendo a amostra de tecido picado para obter a concentração final desejada (ou seja, 50 μL para 1 mg/mL).
   nota: Concentrações mais altas de colagenase aumentarão o rendimento celular, mas podem clivar os marcadores da superfície celular. Portanto, os lotes de colagenase I devem ser titulados para determinar a concentração ideal necessária para obter o maior número de células viáveis com todos os marcadores de superfície celular necessários intactos. Por exemplo, a colagenase I foi testada em concentrações finais de 0,5 mg/mL, 1 mg/mL e 2 mg/mL em amostras únicas de cérebro ou medula espinhal. A viabilidade celular foi determinada pelo método de exclusão do azul de tripano e os marcadores de superfície celular CD45, CD19 e CD4 foram avaliados por citometria de fluxo. Uma concentração de 1 mg / mL de colagenase I produziu a maior contagem de células vivas, mantendo todos os marcadores de superfície celular de interesse. Assim, essa concentração foi usada para experimentos posteriores examinando esses tipos de células.
5. Ressuspenda suavemente o pó de DNase I usando cloreto de sódio 0,15 M até a concentração de estoque desejada. Adicionar a DNase I ressuspensa ao tubo cónico que contém a amostra de tecido picado para obter uma concentração final de 20 U/mL.
   nota: Os lotes de DNase I variam de acordo com as unidades de atividade por mL. A concentração a ser adicionada à amostra de tecido mudará com base nas unidades de atividade do frasco de estoque por mililitro. A concentração final desejada por amostra é de 20 U/mL.
6. Coloque os tubos em um suporte de tubos em banho-maria a 37 ° C e incube por 40 min. Inverta os tubos a cada 15 min para misturar completamente o tecido com as enzimas. Após a incubação, adicione 500 μL de EDTA 0,1 M (pH = 7,2) a cada tubo para uma concentração final de EDTA 0,01 M e incube por mais 5 min para inativar a colagenase.
7. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione 9 mL de RPMI suplementado com 10% de FCS a cada tubo para trazer o volume de cada tubo para ~ 14,5 mL. Centrifugue a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar o sobrenadante utilizando uma pipeta de Pasteur com vácuo, tomando cuidado para não tocar no sedimento celular.
8. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, adicione 3 mL de solução de gradiente de densidade isotônica 100% ao tubo que contém o pellet celular. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione meio RPMI 10% FCS adicional para trazer o volume final para 10 mL e ressuspenda o pellet celular para criar uma camada de solução de gradiente de densidade isotônica de estoque a 30%.
   nota: Prepare o meio de gradiente de densidade isotônico 100% estoque com antecedência, alíquota e armazene a 4 ° C por até 3 meses. Para preparar a solução de gradiente de densidade isotônica 100%, dilua o meio de gradiente de densidade (Tabela de Materiais) com tampão de diluição de meio de gradiente de densidade. Preparar o tampão de diluição do meio de gradiente de densidade (80,0 g/L de NaCl, 3,0 g/L de KCl; 0,73 g/L de Na₂HPO₄, 0,20 g/L de KH₂PO₄; 20,0 g/L de glicose) e esterilizar por filtro usando um sistema de filtro a vácuo. Faça a solução de gradiente de densidade isotônica 100% misturando 1 parte do tampão de diluição do gradiente de densidade e 9 partes de meio de gradiente de densidade. Misture bem.
9. Inverta e misture bem cada tubo antes de adicionar a base da solução de gradiente de densidade isotônica de 70%. Insira uma pipeta sorológica de 1 mL contendo 1 mL de solução de gradiente de densidade isotônica de estoque a 70% no fundo do tubo. Espalhe lentamente 1 mL da solução, tomando cuidado para não formar bolhas. Retirar lentamente a pipeta sorológica do tubo, tomando cuidado para não perturbar o gradiente.
   nota: Para a base de 70%, a solução de gradiente de densidade isotônica de estoque de 100% deve ser diluída a 70% usando mídia RPMI (ou seja, 7 mL de solução de gradiente de densidade isotônica de estoque a 100% e 3 mL de mídia RPMI bem misturada). Além disso, a criação de uma base de 70% limpa e não perturbada é essencial para a remoção de detritos de mielina e para a obtenção de suspensões puras de célula única na interface gradiente após a centrifugação.
10. Centrifugue a 800 x g por 30 min a 4 °C sem freio. Aspire o sobrenadante, incluindo a camada de detritos de mielina até que 2–3 mL permaneçam no tubo, tomando cuidado para não perturbar a camada celular. Colha a camada celular entre o gradiente de densidade de 30/70% usando uma pipeta de 1 mL e transfira para um novo tubo cônico de 15 mL.
11. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione mídia RPMI 10% FCS para trazer o volume final para 15 mL. Centrífuga 450 x g por 5 min a 4 °C.
    nota: Durante esta etapa, as camadas de células de dois tubos podem ser agrupadas, se necessário. Não agrupe mais de dois tubos ou as células não serão pulverizadas devido a uma concentração de mídia gradiente de alta densidade.
12. Aspire o sobrenadante com cuidado para não perturbar o sedimento celular. Ressuspenda as células em um volume/tampão apropriado para contar as células usando um hemocitômetro (por exemplo, ressuspenda uma única medula espinhal em 250 μL de tampão FACS para coloração de superfície a jusante) (Figura 1).
13. Usando uma pipeta de 1 mL, transfira as suspensões de células para o topo de um tubo superior do filtro (Tabela de Materiais) e deixe as células filtrarem para o fundo do tubo para remover quaisquer detritos de mielina restantes.
14. Usando o corante de exclusão azul de tripano, dilua-o e conte as células em um hemocitômetro, calculando a média de pelo menos duas grades de 16 quadrados para precisão40,41.
15. Prossiga com a técnica de análise de célula única desejada.
    nota: O uso de várias formas de colagenase (ou seja, D, tipo I, tipo II, tipo IV), células imunes, microglia (Figura 1), astrócitos, pericitos, células endoteliais 49 e neurônios 50 podem ser isolados com eficiência. As contagens de células nucleadas obtidas para os resultados foram as seguintes usando a enzima colagenase I titulada: Cérebro inteiro tratado com simulação = 500.000–600.000 células; Cérebro TMEV-IDD completo = 800.000–1.000.000 células; Medula espinhal inteira tratada simuladamente = 150.000–200.000 células; Medula espinhal TMEV-IDD total = 300.000–400.000. A contagem de células varia dependendo da precisão da coleta, do processamento e da presença de inflamação do SNC.

Resultados

Figura 1: Identificação de células imunes infiltrantes de CD45hi em tecidos do SNC. (A) Estratégia de bloqueio para a identificação de células imunes infiltrantes de CD45hi (P1), microglia CD45lo (P2) e oligodendrócitos, astrócitos e neurônios CD45- entre o total de células vivas na medula espinhal de camundongos tratados com simulação (vermelho) ou TMEV-IDD (azul). Células CD45hi mínimas foram de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino	ThermoFisher Scientific	37002D
centrifuga	Beckman Coulter	Centrífuga Allegra X-12R
Colagenase I	Worthington	LS004196
Tubo cônico, 15 mL	VWR	525-1069
Tubo cônico, 50 mL	VWR	89039-658
Vidro de cobertura	Hauser Científico	5000
Pinça curva	Ferramentas de Belas Ciências	11003-14
Tubo de poliestireno descartável, 14 mL	Fisher Científico	14-959-1B
DNase I	Worthington	LS002139
Gelo seco	Gás de ar	N/A
Durmont #7Forceps	Ferramentas de Belas Ciências	11271-30
Sal dissódico EDTA di-hidratado	Amresco	0105-500 ouros
Etanol, 100%	qualquer	N/A
Tubo superior do filtro, 5 mL	VWR	352235
Mancha de viabilidade corrigível 780	Becton Dickinson	565388
glicose	Fisher Química	D16-500
Solução salina balanceada de Hank (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemacitômetro	Andwin Científico	02-671-51B
hemostato	Ferramentas de Belas Ciências	13004-14
HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfónico)	ThermoFisher Scientific	15630080
Kcl	Produto químico Fisher	BP366-500
KH2PO4 (anidro)	Sigma Aldrich	Pág. 5655-100G
Nitrogênio líquido	Gás de ar	N/A
Bloco FC do mouse (CD16/32)	Becton Dickinson	553141
Na2HPO4 (anidro)	Fisher Química	S374-500
NaCl	Produto químico Fisher	S671-500
Agulha, calibre 25	Becton Dickinson	305122
Soro normal de camundongo	ThermoFisher Scientific	Rolamento 31881
Filtro de malha de nylon	VWR	Rolamento 352350
Outubro	Sakura	Nº 4583
Paraformaldeído, 20%	Ciências da Microscopia Eletrônica	15713-S	Diluído a 4% usando 1 x PBS
Pipeta Pasteur, 9 polegadas, desconectada	Fisher Científico	13-678-20C
PBS (1x)	Corning	21-040-CV
PE Rato Anti-Rato CD4	Becton Dickinson	Rolamento 553730
PE-CF594 Rato Anti-Rato CD19	Becton Dickinson	562329
Mídia de gradiente de densidade Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rato Anti-Rato CD45	Becton Dickinson	550994
Placa de Petri, 100 mm	VWR	353003
Medidor de pH	Fisher Científico	13-636-AB150
Pipeta-Auxiliar	Corporação Científica Drummond	4-000-101
Pipeta 200 μl	Gilson	FA10005M
Ponteiras de pipeta, 1 mL	EUA Científico	1111-2831
Ponteiras de pipeta, 200 μl	EUA Científico	1111-1816
Pipeta, 1 mL	Gilson	FA10006M
Prolongue o suporte diamantado com DAPI	ThermoFisher Scientific	Pág. 36962
Rato purificado anti-rato CD16 / CD32	Becton Dickinson	553141
Coelho anti-rato CD3 (clone SP7)	Abcam	ab16669
Laminina anti-rato de coelho	Abcam	AB11575
anti-rato ERT-R7	Abcam	AB51824
RPMI 1640	Corning	10-040-CV
Pipeta sorológica, 1 mL	VWR	357521
Pipeta sorológica, 10 mL	VWR	357551
Pipeta sorológica, 5 mL	VWR	357543
hidróxido de sódio	Fisher Científico	S318-100
sacarose	Produto químico Fisher	S5-500
Tesoura cirúrgica	Ferramentas de Belas Ciências	14001-16
Tesoura cirúrgica extra fina	Roboz	RS-5882
Seringa, 10 mL	Becton Dickinson	302995
Seringa, 5 mL	Becton Dickinson	309646
Azul de tripano	Gibco	Rolamento 15250-061