Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação da lâmpada de luz suave (dia 1)
- Use uma placa de acrílico transparente com espessura de 0,3-0,5 cm no tamanho de papel A5. Cole almofadas brancas na frente e atrás da placa de acrílico.
- Instale uma fileira de luzes brancas LED na borda da placa para que as luzes possam entrar pela lateral da placa de acrílico e, em seguida, disparar em paralelo (Figura 1A-F, Figura 2B).
nota: Como os diâmetros dos EBs no estágio inicial são de aproximadamente 200 μm a 300 μm, é difícil observá-los claramente a olho nu sob a lâmpada fluorescente de bancadas limpas. Em contraste, devido ao aumento da reflexão difusa, podemos detectar os EBs claramente usando luz suave iluminada lateralmente (Figura 2B, C). Uma placa de 6 poços é recomendada para culturas EB em experimentos subsequentes. No entanto, para mostrar melhor o efeito visual da luz suave, os pratos às vezes são usados para tirar fotos e vídeos neste estudo em vez de pratos, portanto, não entenda mal. A lâmpada de luz suave iluminada lateralmente também pode ser usada para a placa de 6 poços.
2. Transferência de EB e substituição do meio (dias 2-5)
- Prepare uma nova placa de baixa adesão de 6 poços e adicione 2 mL de meio de formação de corpo embrióide (EB) a cada poço.
- Remova os EBs junto com o meio com uma ponta de pipeta de diâmetro largo de 1000 μL (consulte a Tabela de Materiais) e transfira-os para a placa de baixa adesão de 6 poços (~100 EBs/poço).
nota: O processo de operação adota uma lâmpada de luz suave (mencionada na etapa 1) para facilitar a observação dos EBs. Desligue outras fontes de luz internas para melhorar o efeito visual da luz suave.
- Substitua pelo mesmo volume de meio de formação de EB fresco todos os dias. Use o fluxo secundário para reunir os EBs no centro e alterar o meio.
- Aspire o meio antigo pipetando lentamente até a borda do poço. Não chupe com muita força; caso contrário, os EBs serão removidos juntos. Em seguida, adicione meio fresco para ressuspender os EBs.
nota: O fluxo secundário principal (Figura 2D). Induza um fluxo de redemoinho girando o prato ao longo de uma órbita circular. Devido ao fluxo de redemoinho, um fluxo secundário é induzido e direcionado para o centro. Os EBs ou organoides convergem para o centro do poço devido ao fluxo secundário gerado por rotação, após o qual a mudança do meio ou a transferência embrióide podem ser executadas prontamente.
3. Indução neural (dias 5-7)
- Prepare uma nova placa de 6 poços com baixa adesão e adicione 3 mL de meio de indução neural (Tabela 1) a cada poço.
- Ligue a luz suave lateral (mencionada na etapa 1) e desligue outras fontes de luz internas.
- Transfira os EBs para a placa de 6 poços com meio de indução neural adicionado (~ 100 EBs / poço). Adicione o mínimo possível do meio original ao novo well.
nota: Introduza habilidades simples de transferência de organoides. Naturalmente, sob gravidade e com uma densidade relativamente maior do que o meio, os EBs ressuspensos afundarão gradualmente aplicando a operação mostrada na Figura 2E. Assim, os EBs podem ser convenientemente transferidos. Uma vez que, em comparação com os EBs, as células livres e os fragmentos de células mortas afundam mais lentamente, a maioria das células livres e fragmentos de células mortas pode ser removida por meio desse método de sedimentação ( Figura 2F ).
- Incubar as amostras a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
nota: Ao microscópio, o diâmetro dos EBs era de aproximadamente 500 μm e a borda era translúcida, indicando que uma camada neuroepitelial se formou.
Tabela 1. Composição do meio de indução neural
| Componentes | volume |
| DMEM-F12 | 97 mL |
| Suplemento N2 | 1 mL |
| Suplemento de Glutamax | 1 mL |
| MEM-NEAA | 1 mL |
| heparina | Concentração final 1 μg/mL |
