1. Meios de cultura e preparação de ferramentas
- Pulverize a bancada e a área de trabalho com etanol 70% e deixe secar.
- Pulverize as ferramentas de dissecação, pinças e dois pratos de relógio de vidro, com etanol 70% e deixe-os secar na bancada.
- Faça o meio de Schneider suplementado (SSM, Tabela 1) e coloque-o no gelo.
- Pipete 1 mL de SSM em cada um dos pratos de vidro do relógio.
- Usando uma micropipeta com ponta estéril, transfira as larvas recém-eclodidas da placa de PBS para o SSM no primeiro prato de vidro do relógio. Usando uma micropipeta com ponta estéril, transfira as larvas recém-eclodidas para o SSM no segundo prato de vidro do relógio.
2. Dissecações e culturas cerebrais
- Uma vez que as larvas estejam no segundo prato de relógio de vidro com SSM, disseque os cérebros das larvas usando uma pinça e um microscópio de dissecação. Ajuste a ampliação conforme necessário.
- Use uma pinça para agarrar os ganchos da boca e, com a outra, agarre suavemente o corpo até a metade e puxe na direção oposta (Figura 1) para dividir a larva em dois pedaços.
nota: O cérebro estará localizado logo atrás dos ganchos da boca. Observe que pode haver outros tecidos ao redor do cérebro. Tenha muito cuidado ao remover esses tecidos, pois isso pode resultar em danos ao cérebro.
- Depois que 15-20 cérebros forem dissecados, adicione 1 mL de SSM em um poço de uma bandeja de cultura estéril de 12 poços. Transfira os cérebros recém-dissecados para o SSM usando uma micropipeta e uma ponta estéril (Figura 2A).
- Coloque os cérebros no meio SSM na bandeja de cultura de 12 poços em uma incubadora a 25 ° C por 24 h ( Figura 2A ).
Tabela 1: Receita para fazer mídia Schneider suplementada (SSM). A tabela lista o volume de todos os ingredientes necessários para preparar 5 mL de SSM.
| Ingrediente (concentração inicial) | Para fazer 5 mL | Concentração final |
| Drosophila media de Schneider | 3,89 ml | |
| Soro fetal bovino (100%) | 500 μL< | 10% de sucesso |
| Glutamina (200 mM) | 500 μL | 20 mM |
| Penicilina (5000 unidades/mL), estreptomicina (50.000 μg/mL) | 100 μL | Caneta de 1000 U/mL, estreptococos de 1 mg/mL |
| Insulina (10 mg/mL) | 10 μL | 0,02 mg/mL |
| glutationa (50 mg/mL) | 5 μL | 0,05 mg/mL |
| Em um capuz estéril, usando técnica estéril, adicione todos os ingredientes em um tubo cônico de 14 mL. Coloque-o no gelo até o uso. |
