Isolando oligodendrócitos primários murinos usando grânulos imunomagnéticos

Resumo

Fonte: Flores-Obando, R. E. et al., Isolamento Imunomagnético Rápido e Específico de Oligodendrócitos Primários de Camundongos. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra um método para isolar células oligodendrócitos primárias de uma suspensão de células neurais obtida de um filhote de camundongo usando separação magnética. A técnica emprega esferas magnéticas revestidas com anticorpos específicos para antígenos de oligodendrócitos, permitindo o isolamento seletivo dessas células.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Dissociação do córtex cerebral de camundongos

1. Sacrifique filhotes de camundongos C57Bl/6N pós-natais de 5 a 7 dias por decapitação rápida com tesoura previamente limpa em etanol a 70%.
   nota: Córtices cerebrais de 5-6 filhotes de camundongos recém-nascidos foram usados para cada preparação. Em média, um cérebro de camundongo produz 1-1,5 x 10⁶ oligodendrócitos primários (Ols).
2. Corte a pele do couro cabeludo ao longo da linha média com uma pequena tesoura de dissecação e retraia para expor o crânio.
3. Corte o crânio cuidadosamente ao longo da linha média, começando pela abertura na parte de trás do crânio em direção à área frontal, levantando com a tesoura para evitar danos ao cérebro. Em seguida, usando a abertura na parte de trás do crânio, corte em direção a cada órbita ocular ao longo da base do crânio.
4. Use uma pinça fina para afastar suavemente os córtices do mesencéfalo e transferi-los para uma placa de cultura de tecidos de 60 mm contendo 7 mL de B27NBMA. Repita as etapas 2.2 a 2.4 para cada cérebro, agrupando os córtices dissecados.
5. Transfira os córtices para uma nova placa de cultura de tecidos de 60 mm contendo 5 mL de tampão de dissociação (B27NBMA, 20-30 U / mL de papaína e 2.500 U DNase I).
6. Corte os córtices em pequenos pedaços de cerca de 1 mm³ usando uma lâmina de bisturi # 15 e incube por 20 min em uma incubadora de 37 ° C, 5% de dióxido de carbono (CO₂).
7. Adicione 1 mL de soro de crescimento bovino (BGS) para interromper a reação enzimática.
8. Transferir os córtices juntamente com o meio de dissociação para um tubo cónico de 15 ml utilizando uma pipeta serológica de 10 ml.
9. Comece suavemente a dissociar o tecido cerebral pipetando lentamente para cima e para baixo 6-8 vezes usando uma pipeta sorológica de 10 mL, tomando cuidado para minimizar as bolhas.
10. Deixe os pedaços de tecido assentarem por 2-3 min e transfira o sobrenadante para um tubo novo.
11. Adicione 3 mL de B27NBMA contendo 10% de BGS / 2500 U DNase I ao pellet de tecido.
12. Use uma pipeta sorológica de 5 mL para dissociar suavemente o tecido cerebral enquanto pipeta para cima e para baixo 6-8 vezes. Tenha cuidado para minimizar as bolhas.
13. Deixe os pedaços de tecido assentarem por 2-3 min.
14. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Adicione 3 mL de B27NBMA contendo 10% de BGS / DNase I ao pellet de tecido.
15. Dissocie suavemente o tecido cerebral usando uma ponta de pipeta P1000, enquanto pipeta a mistura de mídia e tecido cerebral para cima e para baixo. Repita as etapas 2.13 e 2.14 até que não restem grandes pedaços de tecido ou até que B27NBMA contendo 10% de BGS/DNase I se esgote, o que ocorrer primeiro. Tenha cuidado para minimizar as bolhas.
16. Suspensão da célula da piscina com sobrenadantes anteriores.
17. Coloque o filtro de células de 70 μm em um tubo de 50 mL. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, passe a suspensão de células agrupadas suavemente sobre o filtro de células de 70 μm.
18. Lave o filtro de células adicionando 1 mL de B27NBMA contendo 10% de BGS / DNase I.
19. Descarte o filtro de células. Traga o volume para 30 mL com B27NBMA contendo 10% de BGS / DNase I.
20. Transfira a suspensão celular para dois tubos cônicos de 15 mL. Centrifugue a suspensão da célula por 10 min a 200 x g.
21. Remover o sobrenadante sem deixar as células expostas ao ar. O sobrenadante ficará turvo devido a detritos celulares. Adicione 3 mL de B27NBMA contendo 10% de BGS ao pellet.
22. Dissocie cuidadosamente o pellet celular usando uma pipeta P1000. Traga o volume para 15 mL com B27NBMA contendo 10% de BGS.
23. Passe a suspensão celular sobre um filtro de células novo de 40 μm.
24. Lave o filtro de células adicionando 1mL de B27NBMA contendo 10% de BGS. Descarte o filtro de células.
25. Leve o volume para 30 mL com B27NBMA contendo 10% de BGS.
26. Transfira a suspensão celular para 2 tubos cônicos de 15 mL. Centrifugue a suspensão da célula por 10 min a 200 x g.
27. Remova a maior parte do sobrenadante sem deixar as células expostas ao ar. Ressuspenda os pellets de células em 5 mL de tampão de classificação magnética de células (MCS) gelado.

2. Determinação da contagem de células e viabilidade

1. Diluir 100 μL da suspensão celular com 400 μL de solução de azul de tripano em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para obter uma diluição de 1:5 em 0,4% (p / v).
2. Centralize uma lamínula sobre uma câmara de hemocitômetro e encha as duas câmaras com 10 μL da diluição celular usando uma pipeta P10 e evitando transbordamento. A solução passará sob a lamínula por ação capilar.
3. Coloque o hemocitômetro na platina do microscópio e ajuste o foco usando ampliação de 40X.
   NOTA: As contagens de células são registradas usando um contador portátil em cada um dos cinco quadrados (quatro cantos e um centro). Apenas as células não viáveis absorvem o corante e aparecem em azul, enquanto as células vivas e saudáveis parecem redondas e refrativas e não absorvem o corante de cor azul, permitindo a determinação do número de células viáveis e totais por mililitro.

3. Isolamento de Oligodendrócitos O4⁺

1. Centrifugue a suspensão da célula a 200 x g por 10 min.
2. Descarte cuidadosamente o sobrenadante usando aspiração a vácuo, evitando a exposição das células ao ar.
3. Ressuspenda o pellet em 90 μL de tampão MCS por 1 x 10⁷ células totais, seguido pela adição de 10 μL de esferas anti-O4 por 1 x 10⁷ células.
4. Misture a suspensão celular e os grânulos sacudindo suavemente o tubo cônico de 15 mL com o dedo 4-5 vezes.
5. Incube a mistura por 15 min a 4 ° C, sacudindo o tubo cônico de 15 mL com o dedo 4-5 vezes a cada 5 min.
6. Lave a mistura adicionando suavemente 2 mL de tampão MCS por 1 x 10⁷ células ao tubo. Centrifugue a mistura a 200 x g por 10 min.
7. Rejeitar o sobrenadante utilizando cuidadosamente a aspiração a vácuo, evitando a exposição das células ao ar. Ressuspenda o pellet celular em 500 μL de tampão MCS para cada 1 x 10⁷ células.
8. Conecte um separador magnético a um suporte separador magnético. Anexar uma coluna de selecção ao separador magnético e colocar um filtro de células de 40 μm no topo da coluna. Coloque dois tubos cônicos de 15 mL ou 50 mL abaixo da coluna de separação para coletar o fluxo.
9. Enxágue previamente o filtro de células de 40 μm e a coluna de separação com 3 mL de tampão MCS e deixe o tampão passar pela coluna sem deixá-lo secar.
10. Adicione a mistura de suspensão celular e grânulos ao filtro de células e à coluna de seleção.
11. Lave o filtro de células de 40 μm com 1 mL de tampão MCS.
12. Descarte o filtro de células e deixe a mistura de células, contas e tampão passar pela coluna sem deixá-la secar.
13. Lave a coluna de separação 3 vezes com 3 mL de tampão MCS e 1 vez com meio de proliferação OL.
14. Remova a coluna de separação do separador magnético, coloque-a rapidamente em um tubo cônico de 15 mL e adicione imediatamente 5 mL de meio de proliferação OL.
15. Coloque um êmbolo no topo da coluna e empurre firmemente para liberar as células marcadas no tubo cônico de 15 mL.
16. Remova 100 μL de suspensão celular para determinar a contagem e viabilidade celular usando Trypan Blue e hemocitômetro conforme indicado na seção 3.
    NOTA: A viabilidade celular acima de 80% é considerada aceitável para prosseguir com a cultura de OLs, mas a viabilidade maior que 90% é ótima.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
pipetas sorológicas de 10ml	Fisher Científico	13-676-10J
Seringa de 10ml Ponta Luer-Loc	BD, Becton Dickinson	309604
Tubos cônicos de 15ml	falcão	352097
Placas de cultura de tecidos de 24 poços	falcão	353935
Filtro de células de 40μm	Fisher Científico	22368547
Tubos cônicos de 50ml	falcão	352098
pipetas sorológicas de 5ml	Fisher Científico	13-676-10H
Placas de cultura de tecidos de 60 mm	falcão	353002
Filtro de células de 70 μm	Fisher Científico	22363548
Anti-O4 grânulos - Anti-O4MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-094-543
Conjunto completo de filtro superior de garrafa Autofil, filtro de 0,22um, 250ml	EUA Científico	Nº 6032-1101
Conjunto completo de filtro superior de garrafa Autofil, filtro de 0,22um, 250ml	EUA Científico	Nº 6032-1102
Suplemento B27	Invitrogen	Rolamento 17504-044
Soro de Crescimento Bovino (BGS)	Ciências da Vida da GE Healthcare	SH30541.03
Bsa	Fisher Científico	BP-1600-100
CNTF	Peprotech	450-50
Desoxirribonuclease I (DNAse I)	Worthington	LS002007
Edta	Fisher Científico	S311
Bisturis descartáveis de penas	Andwin Científico	EF7281C
glicose	Fisher Científico	D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	35050-61
insulina	Invitrogen	Rolamento 12585-014
Suporte separador magnético - MACS multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Separador magnético-Separador MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
Unidade de filtro Millex PES 0,22μm	Millipore	SLG033RS
Meio Neurobasal A	Invitrogen	Rolamento 10888-022
papaína	Worthington	LS003126
PBS sem Ca2+ e Mg2+	sigma	D5652
Solução de estoque DNase I			1. Dissolver a 12.500 U de desoxirribonuclease I/ml em HBSS resfriado em gelo. 2. Esterilize o filtro no gelo 3. Alíquota a 200 μl e congelar durante a noite a -20 ° C. 4. Armazene alíquotas de -20 a -30 ° C.
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (sem Ca2+ e Mg2+)			Dissolva a bolsa em 1 litro de água para obter 1 litro de meio a 9,6 gramas de pó por litro de meio. Conservar a 2-8 °C.
Solução Trypan Blue	Corning	25-900-CI
B27NBMA			487,75 mL de meio neurobasal A; 10 mL de suplemento de B27; 1 mL de primocina; 1,25 mL de glutamamax; Filtrar, esterilizar e conservar a 4 °C até à utilização.
B27NBMA + 10% BGS			27 mL B27NBMA; 3 mL de soro de crescimento bovino
Estoque de solução CNTF (10 μg/ml; 1000X)			Encomende da Peprotech (450-50). Perfazer 0,1 a 1 mg/ml de acordo com as instruções do fabricante (pode variar de lote para lote) em tampão (por exemplo, DPBS + 0,2% BSA). Armazenar a -80 °C. Solução de trabalho (10 μg/ml, 1000X) 1. Faça em 0,2% BSA (BP-1600-100 científico de Fisher) na solução de DPBS e esterilize por filtro. 2. Dilua a alíquota do estoque mestre para 10μg / ml em estéril, resfriado 0,2% BSA / DPBS. 3. Alíquota (20μl / tubo) e congelamento instantâneo em nitrogênio líquido. 4. Armazene alíquotas a -80 °C.
Buffer de classificação de células magnéticas (MCS)			Prepare a solução contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2 e 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), 0,5 mM de EDTA, 5μg / ml de insulina, 1 g / L de glicose. Esterilize e desgaseifique filtrando o tampão, passando-o por um filtro Millex de 0,22 μm. Conservar o tampão a 4°C até à utilização
Sais balanceados de Hank (HBSS) (Sigma			1. Meça 900 ml de água (temperatura 15-20 °C) em um cilindro e mexa delicadamente. 2. Adicione a potência e mexa até dissolver. 3. Enxágue a embalagem original com uma pequena quantidade de água para remover todos os vestígios do pó. 4. Adicione à solução na etapa 2. 5. Adicionar 0,35 gr de bicarbonato de sódio (7,5% p/v) para cada litro de volume final. 6. Continue mexendo até dissolver. 7. Ajuste o pH do tampão enquanto mexe para 0,1-0,3 unidades abaixo do pH = 7,4, pois pode aumentar durante a filtração. Recomenda-se o uso de HCl 1N ou NaOH 1N para ajustar o pH. 8. Adicione mais água para trazer o volume final para 1L. 9. Esterilize por filtração usando uma membrana com porosidade de 0,22 mícrons. 10. Armazene a 2-8 °C.