Preparação de um substrato micropadronizado para estudar fenótipos de células de Schwann

Resumo

Fonte: Xu, Z., Orkwis, et al. Preparação de Microambientes de Matriz Extracelular Sintonizáveis para Avaliar a Especificação do Fenótipo da Célula de Schwann. J. Vis. (2020).

O vídeo descreve a preparação de um substrato micropadronizado para estudar a especificação do fenótipo celular. Um carimbo PDMS micropadronizado revestido de proteína é usado para transferir o micropadrão em uma lamínula revestida com PDMS. A lamínula é então tratada com um surfactante para impedir a adesão celular nas superfícies indesejadas. As células são então adicionadas para se estabelecer no padrão e incubadas para análise posterior.

Protocolo

1. Preparação e caracterização do substrato de cultura de células sintonizáveis

1. Preparação do substrato
   1. Misture o elastômero básico de polidimetilsiloxano (PDMS) e os agentes de cura usando uma ponta de pipeta vigorosamente na proporção entre 10:1 e 60:1 até que as bolhas estejam homogeneamente dispersas dentro da mistura. Remova as bolhas usando dessecação a vácuo até que as bolhas sejam dissipadas.
      NOTA: Durante a polimerização PDMS, o agente de cura reticula com o elastômero base para fornecer as propriedades mecânicas desejadas do polímero final. As relações de reticulação podem ser ajustadas para alterar a rigidez do PDMS.
   2. Coloque uma gota (~0,2 mL) de mistura PDMS desidratada em uma lamínula quadrada ou circular (por exemplo, 22 mm x 22 mm) e gire a lamínula em um revestidor giratório a 2500 rpm por 30 s.
   3. Incube a lamínula em um forno a 60 ° C por 1-2 h ou em temperatura ambiente durante a noite para que o PDMS solidifique.
   4. Trate a lamínula usando limpador de ozônio UV por 7 min (comprimento de onda UV: 185 nm e 254 nm) para aumentar a hidrofilicidade da superfície. Coloque-o em uma placa esterilizada de 6 poços.
   5. Antes de usá-lo para cultura de células, incube substratos em etanol 70% por pelo menos 30 minutos.
      CUIDADO: O limpador de ozônio UV pode gerar ozônio prejudicial aos seres humanos. Trabalhe em uma capela de exaustão química ou com alguma forma de ventilação.
2. Preparação de substrato micropadronizado
   1. Desenhe a geometria desejada e as áreas adesivas da célula (900 μm², 1.600 μm² e 2.500 μm²) usando o software de desenho assistido por computador (CAD). Crie uma fotomáscara cromada com base nesses padrões de um fornecedor comercial.
   2. Em uma sala limpa ou ambiente livre de poeira, use técnicas padrão de fotolitografia para fabricar wafers de silício. Os parâmetros críticos para esta aplicação específica são os seguintes: Fotorresistente: SU-8 2010; Perfil de rotação para dispersar o fotorresistente: 500 rpm por 10 s com uma aceleração de 100 rpm/s, depois 3500 rpm por 30 s com uma aceleração de 300 rpm/s; Energia de exposição da luz UV: 130 mJ/cm2.
      NOTA: A altura dos padrões nos wafers de silício é de aproximadamente 10 μm seguindo esses parâmetros. Possíveis rachaduras ao redor da borda fora dos padrões retangulares ou triangulares podem ser vistas usando um microscópio de luz após a etapa 1.2.2. Assar o wafer de silício a 190 ° C por 30 min ajuda a eliminar as rachaduras.
   3. Coloque o wafer de silício padronizado dentro de uma placa de Petri circular de 150 mm de diâmetro x 15 mm de altura e despeje o PDMS desgaseificado (proporção de mistura 10:1) conforme preparado na etapa 1.1.1 no wafer de silício.
      NOTA: Certifique-se de que a espessura do PDMS seja de pelo menos 5 mm para facilitar o manuseio durante as etapas de impressão por microcontato.
   4. Solidificar o PDMS em um wafer de silício em um forno a 60 ° C durante a noite. Deixe o PDMS esfriar até a temperatura ambiente. Corte com precisão carimbos quadrados de 30 mm x 30 mm contendo os padrões corretos do wafer de silício usando um bisturi cirúrgico. Não danifique o wafer de silício.
      NOTA: Os wafers de silício podem ser reutilizados muitas vezes neste momento para produzir mais selos após a limpeza com isopropanol.
   5. Esterilizar os selos PDMS e as lamínulas ajustáveis (preparadas nos passos 1.1.1 a 1.1.3) imergindo-os em etanol a 70% durante 30 min.
   6. Para confirmar a eficácia do micropadrão dos carimbos PDMS após a impressão por microcontato, seque a superfície dos selos PDMS usando um fluxo de ar filtrado e pipete 50 μg/mL de solução de albumina de soro bovino (BSA) (Texas Red conjugado) para cobrir todo o lado padronizado do carimbo PDMS.
   7. Incube os carimbos PDMS com solução BSA por 1 h em temperatura ambiente para permitir a adsorção de proteínas.
   8. Seque a superfície das lamínulas ajustáveis usando um fluxo de ar filtrado e aumente a hidrofilicidade da superfície conforme descrito na etapa 1.1.5.
   9. Seque ao ar os carimbos PDMS para remover a solução BSA restante.
      NOTA: Tome cuidado para que a solução BSA seja completamente removida do carimbo, pois qualquer solução restante fará com que os carimbos deslizem na lamínula durante a impressão por microcontato.
   10. Coloque o lado padronizado do carimbo em contato conformado com a lamínula ajustável para adsorção de BSA na superfície da lamínula. Pressione suavemente o carimbo contra a lamínula por 5 min.
       NOTA: Não aplique força excessiva no carimbo, pois ele dobrará e causará contato não específico entre o carimbo e a lamínula. A quantidade apropriada de força aplicada ao carimbo é essencial para uma impressão de microcontato bem-sucedida.
   11. Examine o micropadrão usando um microscópio de fluorescência com um filtro FITC (isotiocianato de fluoresceína).
   12. Para imprimir áreas adesivas celulares em vez de padrões fluorescentes, substitua a proteína BSA por laminina e repita as etapas 1.2.5 a 1.2.10.
   13. Remova os carimbos das lamínulas e transfira-as para uma placa esterilizada de 6 poços. Adicione 2 mL de solução de Pluronic F-127 a 0,2% p/v em cada poço para cobrir a superfície da lamínula e incube por 1 h em temperatura ambiente.
       NOTA: O Plurônico F-127 pode ser adsorvido na superfície do PDMS, aumentando a hidrofobicidade da superfície do PDMS para bloquear a adesão das células.
   14. Aspire a solução de Pluronic F-127 e lave 5x com solução salina tampão fosfato (PBS) e 1x com o meio de cultura de células antes de semear as células. Uma densidade de semeadura típica para SCs é de 1.000 células/^cm2.
   15. 45 min após a semeadura celular, remova o meio de cultura celular e lave as lamínulas com PBS 2x para evitar que vários SCs adiram ao mesmo padrão. Manter as células no ambiente de cultura de células desejado durante 48 h antes da quantificação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino (BSA), conjugado Texas Red	Thermo Fisher Científico	A23017	Coloração BSA para mostrar micropadrões
Meio Eagle Modificado de Dulbecco	Thermo Fisher Científico	11965092	Meio de cultura celular
Soro fetal bovino	Thermo Fisher Científico	16000044	Suplemento de meio de cultura celular
Fibronectina	Thermo Fisher Científico	Rolamento 33010-018	Proteína usada para revestir lamínulas
Microscópio de fluorescência	Nikon	Eclipse Ti2	Microscópio de fluorescência
Laminina	Thermo Fisher Científico	23017015	Proteína usada para revestir lamínulas
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Científico	15140122	Suplemento de meio de cultura celular
F-127 Plurônico	Sigma Aldrich	Pág. 2443	Bloquear a ligação a proteínas não específicas
SYLGARD 184 PDMS base e agente de cura	Sigma Aldrich	761036	Polímero ajustável usado para revestir lamínulas
Limpador de ozônio UV	Novascan		Aumentar a hidrofilicidade do PDMS