Isolamento de células de Schwann de raízes espinhais de camundongos

Resumo

Fonte: He, Q., et al., & Ding, F. Purificação de fibroblastos e células de schwann de nervos sensoriais e motores in vitro. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo descreve o isolamento e a cultura de células de Schwann das raízes espinhais de camundongos. As células isoladas são então cultivadas em meios específicos. As células de Schwann são isoladas por digestão diferencial e aderência. Eles são posteriormente transferidos para lamínulas revestidas com matriz extracelular para fixação e proliferação.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Isolamento e cultura de fibroblastos nervosos motores e sensoriais e SC (células de Schwann)

1. Use ratos Sprague-Dawley (SD) de sete dias de idade (n = 4) do Centro de Animais Experimentais da Universidade de Nantong da China. Coloque os ratos em um tanque contendo 5% de isoflurano por 2-3 minutos, deixe os animais respirarem lentamente e não tenham atividade independente e, em seguida, higienize com etanol a 75% antes da decapitação.
2. Use uma tesoura para cortar a pele das costas por cerca de 3 cm e remova a coluna vertebral. Abra o canal vertebral com cuidado para expor a medula espinhal.
3. Mantenha a medula espinhal em uma placa de Petri de 60 mm com 2-3 mL de solução salina balanceada de D-Hanks gelada (HBSS).
4. Com base na estrutura anatômica, excisar a raiz ventral (nervo motor) e depois a raiz dorsal (nervo sensorial) sob um microscópio de dissecação. Em seguida, coloque-os em uma solução salina balanceada de D-Hanks (HBSS) gelada.
5. Depois de remover o HBSS, corte os nervos em pedaços de 3-5 mm com uma tesoura e digerir com 1 mL de tripsina a 0,25% (p / v) a 37 ° C por 18-20 min. Em seguida, suplemente com 3-4 mL de DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) para interromper a digestão.
6. Pipete a mistura para cima e para baixo suavemente cerca de dez vezes e centrifugue a 800 x g por 5 min. Em seguida, descartar o sobrenadante e suspender o precipitado em 2-3 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS.
7. Filtrar a suspensão celular com um filtro de malha 400 e, em seguida, inocular as células numa placa de Petri de 60 mm e cultivar a 37 °C em 5% de CO2. Após 4-5 dias de cultivo, isolar a passagem 0 (p0) de fibroblastos e SCs após atingir 90% de confluência.
8. Isolamento e cultura de SCs (Figura 1)
   1. Lave as células uma vez usando 1x PBS. Adicione 1 mL de tripsina a 0,25% (p / v) (37 ° C) por placa de Petri de 60 mm para digerir as células por 8-10 s à temperatura ambiente. Em seguida, 3 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS foram adicionados para interromper a digestão.
   2. Sopre suavemente a mistura com uma pipeta para separar os SCs. Em seguida, colete e centrifugue os SCs a 800 x g por 5 min.
   3. Descarte o sobrenadante e suspenda o resíduo em 3 mL de DMEM com 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 2 μM de forscolina e 10 ng/mL de HRG e, em seguida, inocule as células em uma placa de Petri de 60 mm não revestida. Após a cultura a 37 °C por 30-45 min, os fibroblastos (alguns fibroblastos são digeridos com SCs) se ligam ao fundo do prato.
   4. Transferir o sobrenadante (incluindo os SCs) para outra placa média revestida com poli-L-lisina (PLL) e cultivar a 37 °C durante 2 dias.

Resultados

Figura 1: O diagrama esquemático mostrando as etapas de separação e purificação de fibroblastos sensoriais e motores e SCs.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina balanceada de D-Hank	Gibco	14170112
DMEM	Corning	10-013-CV
Microscópio de dissecação	Olimpo	SZ2-ILST
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco	10099-141C
Forscolina	sigma	Rolamento F6886-10MG
0,25% (p/v) de tripsina	Gibco	Rolamento 25200-072
Pratos culturais
Tubos de centrífuga
Lamínulas
Poli-L-lisina
Incubadora de CO2