1. Preparação de cultura endotelial de camundongo em insertos de suporte permeáveis
NOTA: As células BEND3 são mantidas de acordo com as instruções do fabricante.
- Prepare o meio celular BEND3 (BM) adicionando 50 mL de FBS e 5 mL de penicilina-estreptomicina em 500 mL de DMEM e misture bem.
- Aspire o meio do prato e lave a cultura de células BEND3 com 1 mL de PBS uma vez. Adicione 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25% (ácido etileno diamina tetracético) às células e incube-as por 4 min a 37 °C.
- Adicione 1 mL de BM às células para neutralizar a tripsina-EDTA e pipete suavemente para cima e para baixo para dissociar completamente as células. Transferir a suspensão celular para um novo tubo cónico de 15 ml e pellet por centrifugação à temperatura ambiente (RT) durante 5 min a 400 x g.
- Aspire o sobrenadante do tubo e ressuspenda as células com 9 mL de MO fresco e, em seguida, adicione 1 mL de suspensão celular em uma inserção de suporte permeável. Adicione mais 2 mL de BM fresco por poço na câmara inferior da matriz. Continue a cultivar as células por um dia.
2. Configuração da cocultura neuroendotelial e do sistema de marcação Ac4ManNAz
- Um dia, depois de revestir as células BEND3 nas inserções, aspire suavemente o meio na câmara inferior primeiro e depois as inserções. Lave a face das inserções 3 vezes com DMEM pré-aquecido (meio de águia modificado de Dulbecco). Lave a superfície externa das inserções enxaguando com DMEM pré-aquecido.
- Adicione 1 mL de AM pré-aquecido (meio aderente) em uma inserção e, em seguida, transfira as inserções para os poços com células corticais primárias. Incubar a co-cultura a 37 °C e 5% de CO2 por 12 h.
- Dissolva Ac4ManNAz em DMSO (dimetilsulfóxido) para atingir uma concentração de estoque de 200 mM. 12 h após a configuração da co-cultura neural-endotelial, adicione 1 μL de estoque de Ac4ManNAz por câmara inferior e 0,5 μL de estoque por inserto na co-cultura. Agite os pratos imediatamente e suavemente para misturar bem o meio. Para as células de controle, adicione um volume igual de DMSO.
- Cultive as células por mais 5 dias a 37 °C e 5% de CO2. Prepare o AM com 10x bFGF como meio de realimentação (RM). Durante esse período, adicione 100 μL de RM por inserção e 200 μL de RM por câmara inferior para realimentar as células endoteliais e neurais em dias alternados. Durante a realimentação, não forneça Ac4ManNAz ou DMSO na cultura.
