Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Soluções e medicamentos
- Solução salina fisiológica (PSS)
- Prepare um mínimo de 1 L de PSS usando 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES) e 10 mM de glicose.
- Preparar soluções necessárias sem CaCl2 (zero Ca2+ PSS) para dissecção de arteríolas cerebrais e isolamento de tubo endotelial.
nota: Preparar todas as soluções em H2O deionizado ultrapuro, seguido de filtração (0,22 μm). Certifique-se de que o produto final contém um pH 7,4 com osmolalidade entre 290 e 300 mOsm.
- Albumina sérica bovina (BSA, 10%)
- Dissolver 1 g do pó liofilizado de BSA num copo de 10 ml de zero Ca2+ PSS. Cubra o copo e deixe pelo menos 2 h com agitação lenta para que o BSA se dissolva.
- Filtrar a solução utilizando uma seringa de 10 ml e um filtro de 0,22 μm e preparar alíquotas de 1 ml para serem conservadas a -20 °C.
- Solução de dissecção
- Adicione 500 μL de BSA (10%) a 49,5 mL de zero Ca2+ PSS para um volume total de 50 mL.
- Transfira a solução para uma placa de Petri para dissecções arteriolares.
- Solução de dissociação
- Adicione 5 μL de solução de CaCl2 (1 M) e 500 μL de BSA (10%) a 49,5 mL de zero Ca2+ PSS para um volume total de 50 mL. Incubar a solução à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
- Enzimas
- Prepare 1 mL de solução de digestão com 100 μg/mL de papaína, 170 μg/mL de ditioeritritol, 250 μg/mL de colagenase (mistura Tipo H) e 40 μg/mL de elastase.
nota: As atividades enzimáticas podem variar, embora protocolos bem-sucedidos provavelmente exijam as seguintes atividades enzimáticas: ≥ 10 unidades/mg para papaína, ≥ 1 unidade/mg para colagenase e ≥ 5 unidades/mg para elastase.
2. Isolamento de arteríolas parenquimatosas
NOTA: As arteríolas originadas das artérias cerebrais médias (MCAs) e embutidas no parênquima cerebral são escolhidas para este protocolo. As arteríolas são isoladas conforme descrito anteriormente11, com modificação.
- Use pinos de aço (diâmetro: 0,2 mm, comprimento: 11 a 12 mm) para prender o cérebro isolado em solução de dissecção a frio em uma placa de Petri contendo um revestimento de polímero de silício com infusão de carvão (profundidade ≥ 50 cm).
- Usando uma tesoura de dissecção afiada e alinhada, corte um retângulo de tecido cerebral (comprimento: 5 mm, largura: 3 mm) (Figura 1B) ao redor da MCA, garantindo que a parte superior do segmento de tecido esteja além do ponto de ramificação do Círculo de Willis. Corte outro retângulo de tecido cerebral do outro hemisfério do cérebro para acessar mais arteríolas, se necessário.
- Prenda o segmento de tecido cerebral separado no prato com o MCA voltado para cima (distal do Círculo de Willis) usando pinos de aço (diâmetro: 0.1 mm, comprimento: 13 a 14 mm). Faça cuidadosamente uma incisão rasa perto dos pinos para remover a pia com uma pequena pinça, descascando suavemente de uma extremidade para a outra (Figura 1C). Remova a pia do outro segmento de tecido para acessar mais arteríolas, se necessário. Prenda cuidadosamente a pia isolada com arteríolas parenquimatosas ramificadas da ACM na placa com os pinos e disseque as arteríolas parenquimatosas (Figura 1D), garantindo que as arteríolas não sejam danificadas.
nota: Se as arteríolas não forem facilmente retiradas com a pia do parênquima, use uma pinça fina e cave no cérebro, começando no ponto de ramificação da ACM do Círculo de Willis. Localize a arteríola, afrouxe cuidadosamente o tecido ao redor das arteríolas (Figura 1E) e puxe suavemente a arteríola para fora do parênquima, segurando a extremidade superior da arteríola (Figura 1F). Múltiplas arteríolas (comprimento: ~ 1,5-2 mm) podem ser isoladas de um retângulo de tecido cerebral.
- Certifique-se de que a arteríola esteja limpa, sem tecido preso a ela, e corte todos os ramos distais restantes (Figura 2A). Use esta arteríola limpa e intacta para digestão enzimática. Alternativamente, corte cada arteríola em dois pedaços (comprimento: 0,75-1 mm) para digestão enzimática para a preparação de tubos endoteliais, se desejado.
3. Digestão de arteríolas parenquimatosas e preparação de tubos endoteliais
- Arranjo de equipamentos e pipetas
nota: O isolamento dos tubos endoteliais arteriais do cérebro foi descrito anteriormente13,18. O protocolo atual incorpora modificações para o isolamento do endotélio das arteríolas parenquimatosas (intracerebrais). Várias arteríolas e/ou pedaços de arteríolas podem ser usados juntos para digestão enzimática.
- Monte o aparelho de trituração13 para a preparação dos tubos endoteliais usando um estágio de alumínio suportando uma câmara e micromanipuladores. Monte um microscópio equipado com objetivas (5x-60x) e uma câmera conectada a um monitor de computador. Prenda uma microsseringa com um controlador de bomba próximo ao stage e amostra.
- Prenda uma pipeta de trituração preenchida com óleo mineral sobre o pistão da microseringa. Use a microsseringa com o controlador da bomba para retirar a solução de dissociação para a pipeta de trituração (~130 nL) em cima do óleo mineral, tomando cuidado para evitar bolhas de ar na pipeta.
- Digestão parcial dos segmentos arteriolares
- Coloque os segmentos arteriolares intactos em 1 mL de solução de dissociação em um tubo de vidro de 10 mL contendo 100 μg / mL de papaína, 170 μg / mL de ditioeritritol, 250 μg / mL de colagenase e 40 μg / mL de elastase. Incube os segmentos arteriolares a 34 °C por 10-12 min.
- Após a digestão, substitua a solução enzimática por 3-4 ml de solução de dissociação fresca à temperatura ambiente.
- Isolamento do tubo endotelial arteriolar
NOTA: Após a digestão e substituição da solução enzimática, transfira um ou vários segmentos parcialmente digeridos para a solução de dissociação em uma câmara de superfusão conectada a uma plataforma móvel. Durante a visualização com ampliação de 100x a 200x, selecione um segmento de vaso parcialmente digerido, mas não interrompido, e concentre-se nele ao microscópio.
- Coloque a pipeta de trituração conectada ao injetor de microsseringa na solução de dissociação na câmara e posicione-a perto de uma extremidade do segmento do vaso digerido. Defina uma taxa dentro da faixa de 1-3 nL/s no controlador da bomba para uma trituração suave.
- Mantendo uma ampliação de 100x a 200x, retirar o segmento arteriolar para dentro da pipeta e, em seguida, ejetar para dissociar a adventícia e as células musculares lisas (Figura 1B). Triturar o segmento do vaso até que todas as células musculares lisas estejam dissociadas e apenas as células endoteliais permaneçam como um "tubo" intacto
nota: Se necessário durante a trituração, use cuidadosamente uma pinça de ponta fina para remover a adventícia dissociada e a lâmina elástica interna do tubo endotelial. Normalmente, apenas alguns ciclos de trituração produzem um tubo endotelial intacto.
- Use micromanipuladores para prender cada extremidade do tubo endotelial na lamínula de vidro na câmara com pipetas de fixação de vidro borossilicato (Figura 2C, D).
- Fixação do tubo endotelial arteriolar
- Substitua a solução de dissociação por solução de superfusão (PSS contendo 2 mM CaCl2), garantindo que o material não endotelial seja removido da câmara.
- Transfira o tubo endotelial seguro na plataforma móvel para o equipamento de microscópio projetado para superfusão contínua e gravações/imagens intracelulares ou fluorescentes.
- Aplique a entrega contínua de PSS durante o experimento. Defina manualmente a taxa de fluxo (5-7 mL / min) durante todo o experimento usando a válvula de controle de fluxo em linha, consistente com o fluxo laminar, enquanto combina a alimentação do fluxo da solução com a extensão da sucção a vácuo. Permita ≥5 min de fluxo de PSS para a câmara para superfusão do tubo endotelial antes de adquirir dados de fundo e/ou carga de corante.
