Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Dissecção do disco intervertebral bovino
- Enxágue bem toda a cauda com água da torneira para remover a sujeira e os pelos da superfície.
nota: Com extremidades distais intactas, um máximo de 9 discos intervertebrais (DIVs) (coccígeo 1-9) por cauda podem ser usados para os experimentos, dependendo do tamanho desejado dos DIVs. Considerando o diâmetro desejado entre 15-20 mm, foram utilizadas 12 caudas bovinas com 5 DIVs por cauda para os experimentos.
- Mergulhe toda a cauda em uma caixa contendo solução de betadina a 1% por 10 min. Seque brevemente a cauda com gaze estéril e coloque-a sobre uma cortina estéril.
nota: Durante a dissecção do disco, umidifique as caudas com gaze umedecida com solução de Ringer para evitar a desidratação. Armazene as caudas (ou segmentos restantes) envoltos em gaze úmida até que todo o procedimento de dissecção seja concluído.
- Use um bisturi (nº 20) para remover o tecido mole o mais completamente possível da coluna caudal para facilitar a identificação dos IVDs. Remova os processos espinhosos e transversos das vértebras com um alicate de remoção óssea.
nota: Selecione IVDs com o diâmetro desejado. DIVs com faixa de diâmetro de 15 a 20 mm foram usados no presente estudo.
- Corte transversalmente com um alicate de osso no meio de cada corpo vertebral para obter segmentos de movimento individuais. Coloque segmentos de movimento em uma placa de Petri com gaze umedecida com solução de Ringer.
- Localize o IVD e a vértebra por palpação e movendo os segmentos de movimento suavemente. Faça dois cortes paralelos com a serra de fita na placa de crescimento dos IVDs, um de cada lado do IVD. Identifique a localização da placa de crescimento tocando e encontrando o local convexo da parte da placa terminal óssea (dura) adjacente ao disco (mole) com uma distância de segurança de aproximadamente 0,5-1 mm do IVD em direção à vértebra. Certifique-se de que a lâmina da serra de fita esteja resfriada com a solução de Ringer enquanto corta as vértebras.
- Transferir DIVs em placa de Petri limpa com gaze limpa umedecida com solução de Ringer.
nota: A gaze deve ser umedecida e não muito molhada para evitar o inchaço dos IVDs,
- Use a lâmina do bisturi para raspar o corpo vertebral (osso vermelho/rosa), placa de crescimento (cartilagem branca), deixe a placa terminal intacta (amarelo-rosa). Faça as duas superfícies planas e paralelas para o procedimento de carregamento. Transferir os DIVs raspados para uma placa de Petri fresca com gaze umedecida com solução de Ringer.
nota: Use uma luva de cota de malha para proteger a mão enquanto segura o IVD e raspa.
- Meça a altura e o diâmetro do disco com um paquímetro. Limpe os coágulos sanguíneos no osso das vértebras com a solução de Ringer usando um sistema de lavagem a jato.
- Transfira os IVDs para tubos plásticos de 50 mL, um IVD por tubo. Adicione 25 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) + 10% de penicilina/estreptomicina (P/S) por IVD e deixe agitar por 15 min em um agitador orbital em temperatura ambiente.
- Aspire o sobrenadante e adicione 10 mL de PBS + 1% P/S por DIV por 2 min para enxaguar os DIVs.
2. Cultura e carregamento de IVD
- Transfira os discos para câmaras de DIV e adicione meio de cultura de DIV (Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L de DMEM com alto teor de glicose para o grupo fisiológico e 2 g/L de DMEM com baixo teor de glicose para o grupo patológico) + 1% de P/S + 2% de soro fetal de bezerro + 1% de ITS (contém 5 μg/mL de insulina, 6 μg/mL de transferrina, e 5 ng/mL de ácido selênio) + 50 μg/mL de ascorbato-2-fosfato + 1% de aminoácido não essencial + 50 μg/mL de agente antimicrobiano para células primárias) e colocar em uma incubadora a 37 °C, 85% de umidade e 5% de CO2.
- Cultivar os discos por 4 dias dentro de um sistema de biorreator de acordo com os grupos experimentais. No grupo patológico, manter condições de carga degenerativa em 0,32-0,5 MPa, 5 Hz por 2 h/dia. No grupo controle fisiológico, utilizar um protocolo de carga de 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz por 2 h/dia.
nota: Posicione os IVDs em câmaras contendo 5 mL de meio IVD durante os procedimentos de carregamento. O volume depende do tamanho das câmaras de carregamento do biorreator. Entre os procedimentos de carregamento, coloque os IVDs em placas de seis poços com 7 mL de meio de cultura IVD para recuperação de inchaço livre.
- Para analisar as mudanças na altura do disco durante o período experimental, medir a altura do disco com um paquímetro após a dissecção do DIV (linha de base) e, em seguida, diariamente após o período de inchaço livre e após carga dinâmica durante o período experimental.
